離子色譜法測定馬來酸阿法替尼中雜質二甲胺的含量

周黎明，尹寧寧，遲雙雙

(1.山東省食品藥品審評認證中心，山東 濟南 250014；2.山東亨利醫藥科技有限責任公司，山東 濟南 250000)

阿法替尼(Afatinib或BIBW2992)是由德國勃林格殷格翰公司研發的多靶點抗癌新藥， 2013年7月美國食品藥品監督管理局(FDA)批準Giotrif(阿法替尼片)用于表皮生長因子受體(EGFR)基因突變的晚期(轉移性)非小細胞肺癌(NSCL)患者的治療，阿法替尼片劑的主藥成分為阿法替尼馬來酸鹽。Giotrif是酪氨酸激酶(TKI)受體的不可逆抑制劑。它與ErbB家族成員EGFR(ErbB1)、HER2(ErbB1)、ErbB3和ErbB4形成的所有同、異二聚體共價結合并阻斷信號傳導，受體突變和/或擴增引起的異常ErbB信號傳導和/或受體配體過度表達都可導致惡性表達[1-2]。阿法替尼目前被作為EGFR突變的一線治療藥物[3-7]。EGFR 基因突變可通過FDA 批準的診斷試劑進行檢測[8]。即使EGFR和HER2靶向治療失敗，阿法替尼仍是這一亞組患者的潛在新型治療選擇[5]。

二甲胺是一種低分子有機胺，廣泛存在于自然環境和水產品中，研究表明，二甲胺是對人體有毒的化合物，對眼和呼吸道有很強的刺激作用。眼睛接觸二甲胺可引起角膜渾濁、損傷，皮膚接觸液態二甲胺會引起壞死，在一些亞硝基和含硝基化合物存在下二甲胺易形成致癌物質N-亞硝基化合物[9]。馬來酸阿法替尼的降解產物中含有二甲胺，為保證用藥安全，需對馬來酸阿法替尼中二甲胺進行限量考察。國內外藥典暫未收載阿法替尼及其制劑的質量標準，目前測定二甲胺的方法主要有高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜-質譜(GC-MS)、毛細管電泳法及離子色譜(IC)法等[10-13]，各方法均有不同的適用范圍。因此，本文根據二甲胺的特性，首次建立了IC法測定馬來酸阿法替尼中二甲胺的殘留量的方法，為馬來酸阿法替尼及其制劑的質量控制以及評價其質量的一致性提供可參考的依據。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑 Dionex ICS-1600離子色譜儀，電導檢測器； Mettler Toledo XPE205電子天平(十萬分之一)；Mili-Q超純水儀；二甲胺鹽酸鹽(國藥集團化學試劑有限公司，純度≥99.0%)；甲磺酸(阿拉丁，純度≥99.5%)；實驗用水為超純水；銨離子(國家標準物質溶液，1.0 g·L-1)；鉀離子(國家標準物質溶液，1.0 g·L-1)。

1.2 試驗溶液的配制

1.2.1 對照品溶液的配制 取二甲胺鹽酸鹽對照品約18 mg(相當于二甲胺10 mg)，精密稱定，置100 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 mL，置200 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為二甲胺對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的配制 取馬來酸阿法替尼適量(相當于阿法替尼10 mg)，精密稱定，置10 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

1.2.3 系統適用性溶液的配制 取二甲胺鹽酸鹽、氯化鉀、氯化銨適量，用水制成每1 mL中約含二甲胺、鉀離子和銨離子各2 μg的溶液，作為系統適用性溶液。

1.3 色譜條件 照離子色譜法(《中國藥典》2015年版0513離子色譜法)測定，用陽離子交換色譜柱(IonPac CG12A，250 mm×4 mm適用)，以10 mmol·L-1甲磺酸溶液為流動相；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測器為電導檢測器，檢測方式為抑制電導檢測，檢測器溫度35 ℃；進樣量20 μL。

2 結果與討論

2.1 系統適用性試驗 取空白溶劑水、系統適用性溶液，照“1.3”項下色譜條件注入離子色譜儀，記錄色譜圖，結果表明各離子間分離度均符合要求(見圖1～2)。

2.2 專屬性試驗 考慮到樣品中的其他常規離子可能會干擾測定，作者將與二甲胺離子較難分離的Na+、NH4+、K+分別注入離子色譜儀，記錄色譜圖，結果見圖3。

2.3 線性關系及范圍試驗 分別配制濃度為0.020 9、0.104 5、0.209 0、0.522 5、1.045、3.135 μg·mL-1的供試品溶液，分別精密量取20 μL，注入離子色譜儀，記錄色譜圖，結果見表1。

表1 線性關系試驗結果

以濃度(C)對峰面積(A)進行線性回歸，得線性回歸曲線方程為：A=91 346C-2 341.2，r=1.00(n=6)。二甲胺溶液的濃度在0.020 9～3.135 μg·mL-1范圍內與峰面積線性關系良好，該線性范圍涵蓋二甲胺檢測標準限度和檢測定量限。

2.4 定量限與檢測限 逐步稀釋對照品溶液(0.522 5 μg·mL-1)，以信噪比約為10∶1，為定量限；以信噪比約為3∶1，為檢測限。試驗結果表明該方法的定量限為0.4 ng，相當于供試品進樣濃度的0.002%；檢測限為0.16 ng，相當于供試品進樣濃度的0.000 8%。

2.5 重復性 精密稱取馬來酸阿法替尼影響因素試驗(光照10 d，已降解出一定量的二甲胺)樣品適量(相當于阿法替尼10 mg)，精密稱定，置10 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，平行制備6份。精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果二甲胺含量的平均值為0.06%(正常樣品二甲胺含量為0.01)，RSD為0.18%(n=6)，結果表明方法的重復性良好。

2.6 儀器精密度 精密量取線性供試品溶液(0.522 5 μg·mL-1)20 μL，注入離子色譜儀，記錄色譜圖，連續進樣6針，峰面積的平均值為43 985，RSD為0.59%(n=6)。

2.7 準確度試驗 供試品貯備液：精密稱取馬來酸阿法替尼741.56 mg(以阿法替尼計約500 mg)，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，作為貯備液。

二甲胺對照品溶液：精密量取鹽酸二甲胺對照品約18.09 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為二甲胺對照品貯備液；精密量取1 mL，置200 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液(濃度約為0.5 μg·mL-1)。

供試品溶液：量取上述二甲胺對照品貯備液(濃度：100.02 μg·mL-1)25.00 mL，置100 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別量取0.80、1.00、1.20 mL各3份，分別置50 mL量瓶中，向其中各加入供試品貯備液10 mL，再加水稀釋至刻度，搖勻，作為回收率供試品溶液。

樣品準確度測定的平均回收率為98.91%，RSD為0.91%(n=9)，結果見表2，由以上結果可知該方法的準確度良好，測定方法準確可靠。

2.8 耐用性 精密量取上述“3.1”項下系統適用性溶液20 μL，分別調整甲磺酸溶液濃度、色譜柱柱溫、流速等條件，依法測定，考察銨離子、鉀離子與二甲胺離子的分離度，結果見表3。

耐用性試驗結果表明，流動相的流速、甲磺酸濃度及柱溫在微小范圍內變動，對二甲胺及相近離子的測定無影響，表明該方法耐用性良好。

2.9 供試品溶液的穩定性試驗 取供試品溶液(0.500 1 μg·mL-1)，分別于配制后0、2、4、8、16、24 h，精密量取20 μL注入離子色譜儀，記錄色譜圖及峰面積，結果供試品溶液中二甲胺離子峰面積在24 h內的RSD為1.78%(n=6)，表明供試品溶液24 h內的穩定性良好。

表2 準確度試驗結果

表3 耐用性試驗結果

3 結論

3.1 空白溶劑中存在微量鈉離子，可能來源于配制流動相及溶劑過程中的玻璃容器，但不干擾二甲胺離子的檢測。

3.2 本方法通過對二甲胺的專屬性、線性與范圍、精密度及準確度等方法學驗證試驗研究，說明該方法能夠準確可靠地測定馬來酸阿法替尼中雜質二甲胺的含量。