基于發酵過程的淡豆豉6種黃酮類成分質量控制研究

李鷙，曹冬英，許文，褚克丹，隋利強，徐偉

(福建中醫藥大學藥學院，福建省中藥炮制技術傳承基地，福建 福州 350122)

淡豆豉是以豆科植物大豆[Glycinemax(L.)Merr.]為主料，以桑葉、青蒿為輔料經過發酵加工而成的制品。性苦、辛，涼。歸肺、胃經。中醫理論認為淡豆豉具有解表，除煩，宣發郁熱的功效，可用于感冒，寒熱頭痛，煩躁胸悶，虛煩不眠的癥狀[1]。淡豆豉主要活性成分為黃酮、皂苷、蛋白、多糖、氨基酸、纖溶酶和揮發性等化合物[2-6]。其中，黃酮類成分中的大豆苷具有明顯的抗骨質疏松作用[7]，黃豆黃苷具有較高的α-葡萄糖苷酶抑制活性[8]，染料木苷具有抗腫瘤和抗氧化活性[9]，大豆苷元具有顯著的抗菌活性和降血糖作用[10-11]，黃豆黃素具有促成骨細胞增殖[12]和抗氧化能力，染料木素也具有明顯抗腫瘤、抗氧化、降血脂、抗肝纖維化和改善更年期癥狀等藥理活性[13]。淡豆豉中的黃酮類成分被認為是其主要活性成分，其分為游離型苷元和結合型糖苷兩類，本試驗對市場上購買及企業收集的淡豆豉的6種黃酮類成分的含量進行比較，建立能同時測定其中多種指標成分的方法，對于其質量控制和確保療效具有重要的意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1260 型高效液相色譜儀(美國Angilent公司)；CPA225D 型十萬分之一分析天平(德國Sartorius公司)；KQ-500E 臺式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。

1.2 試藥 對照品大豆苷(批號：MUST-16031507)、黃豆黃苷(批號：MUST-17032503)，染料木苷(批號：MUST-16021802)、大豆苷元(批號：MUST-17101202)、黃豆黃素(批號：MUST-17092210)、染料木素(批號：MUST-15090908)均購自成都曼思特生物科技有限公司，以上標準品純度均大于98%。淡豆豉樣品(編號為S1～S13)和淡豆豉原料黑豆(編號為S14)分別在市場和企業中收集，S1～S14信息詳見表1。甲醇、乙腈為色譜純(德國Merck公司)；甲酸為色譜純(上海阿拉丁試劑有限公司)，其余試劑均為分析純。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件 采用Phenomenex Luna C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～5 min，5%～5% A；5～8 min，5%～30% A；8～15 min，30%～40% A；15～20 min，40%～60% A；20～30 min，60%～70% A；30～33 min，70%～5% A；33～38 min，5%～5% A)，柱溫30 ℃，流速0.8 mL·min-1，進樣量10 μL，檢測波長254 nm。在此色譜條件下6種對照品理論板數均大于5 000，色譜峰對稱性良好(見圖1)。

A.混合對照品；B.供試品 1.大豆苷；2.黃豆黃苷；3.染料木苷；4.大豆苷元；5.黃豆黃素；6.染料木素

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密取大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素對照品適量，精密稱定，加入甲醇超聲溶解，制成質量濃度分別為1.056、1.112、0.968、1.024、0.134和1.024 mg·mL-1的單一對照品儲備液，備用。分別精密量取上述對照品溶液適量，置同一容量瓶中，加入50%甲醇至刻度，即得大豆苷52.8 μg·mL-1、黃豆黃苷55.6 μg·mL-1、染料木苷48.4 μg·mL-1、大豆苷元51.2 μg·mL-1、黃豆黃素53.6 μg·mL-1和染料木素51.2 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取淡豆豉粉末約2 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min(功率250 W，頻率50 kHz)，放冷，再次稱重，甲醇補足減失重，搖勻，0.22 μm濾膜濾過，取續濾液，得供試品溶液。

2.3 線性范圍考察 取大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的混合對照品溶液，用50%甲醇稀釋配制為不同梯度濃度的混合對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進行測定。以大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素質量濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，分別繪制標準曲線，得回歸方程和線性相關系數r，結果見表2。

表2 淡豆豉中6種分析物的線性范圍考察

2.4 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，1 d內連續進樣6次，計算大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素峰面積的RSD分別為0.79%、0.83%、1.11%、1.31%、0.96%、0.73%，結果表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗 取編號為S12的淡豆豉粉末，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12和24 h按“2.1”項下測定大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的峰面積，結果RSD分別為1.11%、2.89%、1.63%、0.87%、1.06%、1.25%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.6 重復性試驗 精密稱取同一批淡豆豉粉末(編號為S12)6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下測定各成分的峰面積，帶入標準曲線計算大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的平均含量分別為17.62、27.46、57.07、372.38、129.74、311.18 μg·g-1，RSD分別為1.23%、1.42%、1.78%、1.18%、2.99%、1.16%，結果表明方法重復性良好。

2.7 回收率試驗 取重復性試驗同批次淡豆豉粉末約1 g，精密稱定，平行6份，每份分別精密加入近似等量的6種對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下測定各成分的峰面積，計算各個化合物的回收率和回收率的RSD結果見表3，結果表明該方法回收率良好。

2.8 耐用性試驗

2.8.1 改變色譜柱 取淡豆豉粉末(編號為S12)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。按“2.1”項下以不同色譜柱：Phenomenex Luna C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Thermo Betasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)和Welch Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)進樣測定，記錄峰面積并計算6種分析物的含量，結果表明本色譜條件在一定色譜柱變動情況下耐用(見表4)。

表3 淡豆豉6個分析物的回收率試驗結果(n=6)

2.8.2 改變流動相pH 取淡豆豉粉末(編號為S12)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。在甲酸體積分數為0.05%、0.10%、0.15%情況下，按“2.1”項下測定6種分析物的含量，結果表明本色譜條件在一定流動相pH值變動情況下耐用(見表4)。

2.8.3 改變流速 取淡豆豉粉末(編號為S12)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件以不同流速(0.6、0.8、1.0 mL·min-1)進樣測定，記錄峰面積并計算6種分析物的含量，結果表明本色譜條件在一定流速變動情況下耐用(見表4)。

表4 耐用性試驗結果

2.8.4 改變柱溫 取淡豆豉粉末(編號為S12)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件以不同柱溫(25、30、35 ℃)進樣測定，記錄峰面積并計算6種分析物的含量，結果表明本色譜條件在一定柱溫變動情況下耐用(見表4)。

2.9 樣品含量測定 取編號為S1～S14的樣品粉末，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，依法測定不同編號的粉末，計算各樣品中大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的含量，結果見表5。

表5 樣品含量測定結果(μg·g-1)

注：“-”表示未檢出

3 討論

檢測波長的選擇，通過對6種分析物進行DAD全波長掃描，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的最大吸收波長分別為250、258、260、248、257、260 nm，綜合6種黃酮類成分在254 nm處均有良好的紫外吸收。因此，選擇254 nm作為檢測波長。

流動相選擇，分別比較了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水溶液系統及其不同比例梯度洗脫效果，結果發現用乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫時，黃豆黃苷不能出峰，其他色譜峰重疊，而用甲醇-水梯度洗脫時，6種成分峰形不佳，改用甲醇-0.1%甲酸水溶液洗脫時，6種成分的分離效果明顯改善，且峰形較好，基線穩定。故最后采用甲醇-0.1%甲酸水溶液作為色譜流動相。

通過分析方法學的驗證，本試驗驗證了該方法的精密度、穩定性、重復性、線性范圍和加樣回收率等均符合分析要求。最后通過對不同來源樣品的含量測定，結果表明，市場上收集淡豆豉的成品與企業生產的相比，其黃酮類成分含量普遍偏低，這可能市場上銷售的部分淡豆豉可能省略了再悶過程，從而使產品質量較差。且不同來源淡豆豉黃酮類單體成分的含量差別也較大，推測與藥材的生長環境、炮制加工方法的不同有關。此外，通過對福建咸康藥業有限公司收集的原料黑豆和淡豆豉成品研究發現，淡豆豉中苷元成分的含量顯著增加，糖苷成分明顯減少，提示淡豆豉的炮制存在由苷向苷元轉化的過程。說明大豆經炮制后，糖苷配基解離，得到游離型的苷元，其生理活性增強，從而使淡豆豉的藥用價值得到充分體現。

根據耐用性試驗要求，我們針對其進行了不同品牌色譜柱、不同流動相pH、不同流速及不同柱溫的考察。結果表明，不同色譜條件下6種分析物的含量具有良好的重現性，RSD小于1%。色譜條件在一定范圍內變化對試驗結果影響較小，表明方法耐用性良好。

綜上所述，本試驗所建立的高效液相色譜(HPLC)法同時測定淡豆豉中大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素含量的方法操作簡便、穩定、準確且可行，可以為淡豆豉質控的提升提供參考，進一步為淡豆豉的炮制化學、炮制發酵機制和發酵產物的活性評價奠定基礎。