清熱藥抗呼吸道合胞病毒的研究進展

馬元榮，孫鐵鋒，王平,4，杜海濤，張恒龍

(1.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2.長清區平安街道社區衛生服務中心，山東 濟南 250300；3.山東省中醫藥研究院，山東 濟南 250014；4.天津大學精密測試技術及儀器國家重點實驗室，天津 300072；5.山東東營勝利油田中心醫院放射科，山東 東營 257000)

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是一種有胞膜的單股負鏈RNA 病毒，屬副粘病毒科肺炎病毒屬，RSV傳染性極強。主要是通過空氣飛沫和密切接觸傳播。多見于新生兒和 6 個月以內的嬰兒。3～7 日，是導致幼兒急性下呼吸道疾病(LRTI)和住院的主要病原體[1],嚴重時可導致呼吸衰竭甚至死亡。RSV 感染已被列為全球性公共衛生問題。RSV易侵犯體弱和年老的人群，全球每年3 380萬5 歲以下的兒童因感染RSV患病，其中340萬患兒因急性下呼吸道感染需要住院治療[2-4]，約92萬例5歲以下兒童死于繼發性肺炎,占所有死亡例數的15%[5];美國RSV感染引起 78%的死亡是65歲以上的老人,直接導致心臟衰竭和繼發性細菌性肺炎[6]。目前臨床沒有治療 RSV 感染的特效藥，常用的抗病毒藥物為利巴韋林(Ribavirin，俗稱病毒唑)，其具有廣譜性、毒副作用大、耐藥性強，近年臨床應用呈下降趨勢[7]；純化合物新藥的開發難度大、周期長、費用高,且化學藥物存在毒副作用大、易產生抗藥性等問題。疫苗還處于臨床試驗階段，沒有許可上市。中醫藥2 000 多年的醫治病毒性疾病的寶貴經驗。近年來，國內外研究者已從中藥中篩選出了大量抗病毒藥物，在臨床上的應用也越來越多。因此探尋新的具有抗RSV 活性的藥物具有重要意義。

清熱藥是以清解里熱為主要作用的藥物,其能清解里熱、治療五臟各種熱性疾病。藥性多為寒涼，少數平而偏涼，味多苦，或甘，或辛，或咸。多入肺、胃、心、肝、大腸經[8]；有效成分為生物堿、黃酮類、苷類、揮發油、酚類等化合物,其中的苷類和黃酮類具有抗菌、抗病毒、增強機體免疫力的作用[9],臨床上主要用于熱病高熱、痢疾、癰腫瘡毒、目赤腫痛、咽喉腫痛等各種里熱證候。因藥性及適應證的不同，可分為清熱瀉火藥、清熱燥濕藥、清熱涼血藥、清熱解毒藥和清虛熱藥5類。清熱瀉火藥常用于醫治氣分熱證和臟器火熱證，功效表述為“清氣分熱、清肺熱、清胃熱；清熱燥濕藥除濕熱，常用來醫治各種濕熱證；清熱涼血藥有清解營分、血分熱邪之功效；清熱解毒藥具有清解火熱毒邪作用，以 “解毒”為主“清熱”為輔，主用于實火熱毒所致的病癥；清虛熱藥能清虛熱、退骨蒸，主用于午后潮熱，低熱不退等癥。本文從清熱藥的抗RSV西藥局限性、藥理作用、抗RSV病機制、抗 RSV 藥物的篩選思路等方面進行綜述,為下一步從清熱藥類中篩選抗RSV特效中藥提供一些新思路。

1 目前抗 RSV 藥物的局限性

目前美國食品藥品監督管理局(FDA)批準用于預防和治療 RSV 感染的藥物是吸入型利巴韋林和帕利珠單抗，但是這兩種藥物主要用于 RSV 感染的高風險患者，其效果仍存在異議[10-11]。

利巴韋林(Ribavirin)是人工合成的核苷類抗病毒藥，該藥的抗病毒機制是抑制RSV的復制,同時可以啟動AKT-NF-κB途徑、增加Bcl-2、減少Bax 蛋白表達,從而抑制RSV感染誘導的 A549 細胞初期凋亡[12]，但對病毒無直接滅活作用。它是唯一獲準用來治療RSV引發的下呼吸道感染住院患者的抗病毒藥物，但仍有其局限性，如價格昂貴、治療效果欠佳，且不良反應較多，尤其是在大劑量、長時間應用利巴韋林注射劑治療病毒性感染時，會出現可逆性貧血，白細胞數量減少，肝功能異常以及腸胃功能下降等，其作為抗病毒藥物，在使用上受到了很大的限制。但停藥后可恢復[13]。

帕利珠單抗(palivizumab)是一種IgG1型的RSV中和單克隆抗體，作用靶點是F蛋白抗原位點Ⅱ的保守表位，抑制F蛋白介導的細胞融合。在發達國家能明顯降低高危兒童RSV感染住院率但成本費用昂貴，96%的兒童RSV流行發生在發展中國家，他們難以負擔帕利珠單抗的高額費用[14]。

疫苗可以有效地預防病毒感染。RSV中F蛋白是單克隆抗體藥物及疫苗研制的主要對象[15]。為了有效預防RSV感染性疾病發生,人們一直在研制RSV疫苗,尤其現在對RSV免疫學有了更深研究，再加上新型疫苗技術的介入我們研發了一些適用于不同人群的疫苗，如兒童、孕婦或者體弱老人，曾先后有減毒活疫苗、亞單位疫苗、載體疫苗和納米顆粒疫苗等問世,但仍沒有疫苗獲得許可上市[16]。RSV 的流行具有明顯的氣候、季節分布特征,又稱為季節性流行病毒，其表面抗原變異性強，不同的流行季節可能出現多種 RSV亞型，并且基因型相互轉變，隨時發生新的取代舊型基因型，導致RSV重復感染[17-18]。現有的RSV疫苗的免疫原型差，RSV的非結構蛋白可通過抑制Ⅰ型干擾素分泌、影響樹突細胞成熟和 T 細胞反應、下調 STAT2 表達等方式抑制自燃免疫和適應性免疫，干擾疫苗效果[19]。

2 清熱藥與抗病毒相關的藥理作用

機體感染 RSV 后，RSV 作為外源性致熱原與呼吸道上皮組織細胞表面的TLRs 結合,激活細胞產生和釋放內生致熱原(endogenous pyrogen,EP),如白細胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等，IL-8、TNF等通過血-腦脊液屏障作用于體溫調節中樞的體溫調定點,將體溫調定點上移，使機體產熱增加，末端血管收縮，汗毛孔關閉等，散熱減少，體溫上升引起發熱[17，20]。

同時上皮細胞產生大量的細胞因子以及趨化因子等炎癥因子，如炎癥因子IL-6、IL-17、TNF-α、IL-29等，引發氣管以及支氣管痙攣等上皮細胞的病理改變，例如黏液分泌量增多、上皮細胞碎片的脫落及中性粒細胞聚集等，這些病理改變引起細支氣管的阻塞，進而導致炎癥及疾病的產生。

我國中草藥資源豐富，中醫藥文化底蘊醇厚。中醫講究采用與疾病的證候性質相反的中藥治，即治療熱性疾病，投以寒藥；但凡內熱之高熱、惡熱、煩渴、濕瘡濕疹、濕溫、夜熱早涼等,俱可使用清熱藥。《神農本草經》曰“療熱以寒藥”。《黃帝內經》中指出：“熱者寒之”的意義，即“熱者寒之”語出《素問·至真要大論》。證屬于熱的，用寒涼性藥物治療。熱證有表熱、里熱、虛熱、實熱等不同，屬于里的用“清法”。因此中醫常用清熱藥主治里熱證。

現代藥理研究表明，清熱藥具有解熱、抗炎、抗病原微生物作用、調節免疫功能及抗腫瘤等多種藥理作用，具有很好的研究價值和應用前景。其抗病毒方面的活性尤其受人關注，這些藥理活性主要與其含的酚類、苷類和黃酮類成分有關。

2.1 解熱作用 據本草及民間草藥記載，結合現代藥效學，發現多種中草藥具有很好的退熱作用，如石膏、知母[21]、柴胡、黃連，其清熱藥的解熱作用可能與抑制細胞反應因子有關。

鄒珊珊等[18]研究連翹提取物不同給藥途徑對副流感病毒致熱家兔發熱模型的影響時發現，連翹酯苷靜脈注射和口服灌胃均能降低家兔的體溫,但靜脈注射的解熱作用優于口服灌胃。其解熱作用可能是抑制家兔下丘腦組織中神經元cAMP釋放，從而降低下丘腦cAMP含量,致使體溫下降。周永學等[22]研究中藥石膏解熱抗炎作用，用合格大鼠按體重隨機分為空白對照組、模型對照組、生石膏組、煅石膏組、CaSO4·2H2O組、阿司匹林組,每組分別連續灌胃7 d，用干酵母誘導大鼠發熱，于2、3、4、5、6、7、8、9、10 h測大鼠肛溫，結果發現生石膏能明顯降低發熱大鼠的溫度，其機制可能與降低下丘腦PGE2含量有關。

2.2 抗炎作用 柳金英等[23]從中西醫結合角度闡述中醫“熱毒”的主要表現是炎性反應,大量臨床研究表明，許多清熱藥對炎癥的各個環節均有一定的抑制作用，如金銀花、連翹、黃連、梔子、穿心蓮、蒲公英等[24]。

Lou等[25]研究金銀花提取物綠原酸治療類風濕性關節炎時發現，綠原酸可以抑制由 IL-6引發的成纖維細胞樣滑膜細胞(FLSs)炎性增殖，主要與JAK- STAT，NF-κB2條信號通路相關，可以顯著減少JAK/STAT 通路上p-STAT3與JAK1 的表達以及NF-κB 通路上p50 與IKK 的表達，抑制IKK的磷酸化。Jang等[21]用仙鶴草提取物改善高脂飲食大鼠糖耐量時發現，高脂飲食可引起肝臟組織的炎癥反應，仙鶴草提取物可以降低血清TNF-α、IL-6水平，抑制炎癥反應，改善糖代謝。

2.3 抗病原微生物作用 大多數清熱藥都有一定程度的抑菌、抗病毒作用，如黃柏、黃芩、黃連、連翹、防風、金銀花、千里光等；但其抗病原微生物范圍和強度各不相同。抗病原微生物作用的發揮途徑主要是通過調動體內積極因素以減輕細菌、病毒對組織細胞的破壞作用和降低病原微生物毒理的方式。

陳仁德等[26]制備黃連、黃芩、連翹的中草藥提取物，采用紙片瓊脂擴散法測定抑菌圈大小，結果顯示以上3種藥物提取物均對金黃色葡萄球菌的敏感性較高，抑菌圈大于6 mm，因此說明對金黃色葡萄球菌的抑制度較強。

徐碩超[27]研究黃芩、黃連抑菌作用效果，以大腸桿菌、嗜酸乳桿菌為實驗菌株，用比濁法來測定以上清熱藥對大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)時發現，黃芩、黃連對大腸桿菌和嗜酸乳桿菌均有抑制作用。姚凝[28]用苦參提取物(氧化苦參堿)對慢性乙肝病人的外周血單個核細胞(PBMCs)進行刺激,發現氧化苦參堿可刺激 PBMCs 釋放大量干擾素α(IFN-α)和干擾素γ(IFN-γ)，以發揮其抑制HBV作用。

2.4 對機體免疫功能的影響 清熱藥物能普遍地影響機體免疫功能的各個方面，可提高細胞的吞噬能力，促進抗體生成及細胞免疫,從而增強機體的免疫功能;又能抑制異常的免疫反應[24]， 如板藍根、蒲公英、紫花地丁、半枝蓮。劉小藝等[29]綜述黃連素對腸道黏膜免疫功能有較好的調節作用。闡述黃連素可能是通過抑制Th1、Th17細胞的分解及促炎癥因子IL-6、IL-23、IL-2等的分泌，提升Treg 細胞對機體免疫作用。李吉萍等[30]研究板藍根多糖 (RIP) 抗腫瘤作用時發現不同劑量的板藍根多糖均可明顯抑制腫瘤的生長,同時還增強脾淋巴細胞及 NK細胞的殺傷活性,升高血清中TNF-α、INF-γ 和 IL-2的含量。由此推斷出，RIP能增強荷瘤小鼠的免疫功能,能延長荷瘤小鼠的生存時間。

3 清熱藥抗 RSV 的機制研究

清熱藥主要通過直接和間接兩種途徑發揮抗 RSV 的作用,即祛邪兼扶正功能[31]。“祛邪”指藥物直接作用于病毒，阻斷病毒對受體細胞的吸附、穿入、復制、蛋白質合成等繁殖過程的某一環節，繼而殺滅病毒，達到抗病毒作用;“扶正”則為間接抑制病毒，即藥物通過調節機體的免疫功能或通過誘生干擾素(IFN)達到抗病毒的目的[32]。

3.1 直接抗病毒作用 黃筱鈞[33]研究甘草抑制RSV機制，以利巴韋林為對照，用噻唑藍(MTT)法測定，逐日記錄細胞病變效應(CPE)。結果發現甘草抑制病毒DNA聚合酶的活性進而抑制RSV在細胞內的增殖；甘草的活性成分能破壞RSV表面的蛋白結構從而阻斷RSV與細胞的吸附，RSV包膜等結構的活性成分被甘草破壞，導致RSV直接被滅活。

劉釗等[34]設置抗病毒口服液和病毒唑為對照組，觀察病毒引起的CPE，用MTT法計算病毒抑制率發現，大青葉抑制RSV是發生在病毒入侵細胞后，干擾病毒基因組的復制或者阻止病毒蛋白合成，從而阻斷 RSV的復制周期。

3.2 間接抗病毒作用(免疫調節作用) 通過作用TLR/IFN-γ，激活細胞對 RSV 的免疫反應，促進細胞因子的釋放，增加免疫球蛋白的合成，發揮抗病毒效應[35]。張沛等[36]研究黃芩抗病毒作用，采用ELISA法檢測大鼠體內Ⅰ型干擾素和炎性因子IL-6和IL-12的表達量的變化，結果顯示黃芩苷可上調RSV感染大鼠體內Ⅰ-IFN的表達，并可能通過下調IL-6和IL-12的水平來抑制SOCS1/3的表達，發揮抗病毒作用。

侯憲邦等[37]研究板藍根含藥血清對呼吸道合胞病毒(RSV)感染RAW264.7細胞后對干擾素-β(IFN-β),Toll 樣受體3(TLR3)、TBK1、干擾素調節因子3(IRF3)的表達，實驗以不同濃度的利巴韋林含藥血清為對照組，發現板藍根含藥血清下調TLR3信號通路關鍵信號分子 TLR3、TBK1、p-IRF3蛋白高表達有劑量依賴性，可以通過信號轉導作用導致IRF3磷酸化增加，從而適度降低IFN-β的過量表達而發揮抗RSV的作用。

4 從清熱藥中篩選抗 RSV 藥物的思路

RSV感染主要為下呼吸道感染，如肺炎或細支氣管炎等，臨床表現主要為發燒、咳嗽、喘息、呼吸困難等癥狀。RSV 感染致病機制：RSV 感染首先直接導致氣道黏膜損傷，造成氣道阻塞，間接性促進了氣道炎癥的發生。其次刺激機體釋放大量細胞因子和趨化因子，激活機體的固有免疫應答、B 細胞介導的體液免疫應答及 T 細胞介導的細胞免疫應答，從而達到抗 RSV 的作用。因此我們可以從抑制炎癥和增強機體免疫力兩方面探尋新的具有抗 RSV 活性的藥物[38]。

中醫通過辨證論治，多成分、多靶點治療不斷變異的病毒感染性疾病，具有安全、高效、不良反應少、無耐藥性等療效優勢,因此篩選高效低毒的抗病毒中藥是當前抗病毒研究熱點之一。臨床實踐證明清熱藥在抗呼吸道合胞病毒感染方面療效顯著，尤其是清熱解毒類中藥，除殺滅病原微生物外，還具有多種免疫學活性，能非特異性增強免疫系統功能,改善機體狀況,調動機體免疫功能，增強對各種感染的抵抗力。臨床中我們更注重病毒-機體-藥物三者的關系，多途徑、多環節達到整體綜合調節作用。因此，我們應該把清熱藥作為篩選抑制RSV中藥的首選對象。

4.1 Meta 分析 Meta 分析是系統綜述中將以往同類研究的結果進行綜合分析的一種方法。李躍文等[39]用網狀Meta 分析補益類中藥注射液輔助治療病毒性心肌炎的作用效果，對納入的文獻分析得出：與單用常規治療比較，生脈注射液、參麥注射液、黃芪注射液、參芪扶正注射液 4 種補益類中藥注射液聯合常規較好輔助治療病毒性心肌炎，但是提高總有效率及改善心電圖方面參麥注射液為首選項,而黃芪注射液能更好降低心肌酶 (CK-MB、AST) 水平。

我們可以通過網狀Meta全面分析比較國內外清熱藥抗病毒的研究現狀和熱點。甚至用網狀Meta技術評價中藥聯合常規西藥治療RSV感染性疾病的療效，為進一步臨床用藥治療病毒感染性疾病提供理論依據。通過網狀Meta了解中藥抗病毒作用的有效性和安全性，判斷某類具體藥物抑制病毒作用的效果和強度，藥物通過哪種方式(直接滅活、阻止病毒吸附和抑制生物合成)發揮抗病毒作用，更為我們后期做清熱藥體外抗 RSV 藥理學試驗做好準備。

4.2 網絡藥理學 Hopkins[40]2007年首次提出了網絡藥理學的概念。在中藥藥理作用機制研究、藥物重新定位、先導化合物的發現、新藥靶的識別以及毒副作用研究等方面取得了較好成績，具有系統預測、動態分析等特點的研究手段,與傳統中醫藥整體觀與辨證論治的原則是一致的。

蘇真真等[32]利用網絡藥理學中的分子對接技術分析銀黃口服液成分的化學空間分布及主成分，發現藥物中含有治療呼吸道感染疾病的活性化合物。藥-靶網絡圖的虛擬篩選，分析出藥物發揮炎癥反應的潛在靶標，推測出了銀黃口服液抗呼吸道感染的藥效物質。衡霞等[41]利用網絡藥理學技術成功篩選出黃連解毒湯的有效成分，根據活性成分進行潛在靶點信息預測、通路分析及分子對接分析等，發現黃連解毒湯作用某靶點，影響相應產物的代謝，從而調節巨噬細胞炎癥反應。

挖掘中藥藥效成分和預測其潛在功能靶標是網絡藥理學研究的兩項基礎工作,藥物-靶點預測技術是網絡藥理學研究的核心技術之一。我們可通過“藥物-靶點-疾病”網絡模式,使用高通量技術快速有效地篩選清熱藥中抗RSV的活性成分,預測出清熱藥活性分子抗RSV的具體作用機制。為我們下一步的體外細胞實驗驗證工作減少工作量,降低新藥開發成本。

5 展望

呼吸道合胞病毒(RSV)是全球、也是我國 5 歲以下兒童呼吸道感染的主要病原體,也是繼肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌之后第三位致兒童肺炎死亡的病原體[42]。其主要病變在毛細支氣管，亦可涉及支氣管與肺泡，更是嬰幼兒、老年人和免疫功能低下者誘發呼吸道感染的主要原因[43]。現在仍沒有令人滿意的安全性好針對性強的疫苗出現,供臨床使用醫治RSV的藥品較少。目前國內外在中西醫方面對抗RSV的研究日益增多，西醫講究對癥治療RSV感染，其藥物主要為抗病毒藥物、支氣管擴張劑、抗炎藥和免疫調節劑等。但這些藥物對機體存在嚴重的毒副作用,而疫苗免疫率又較低。與化學藥相比,中藥可通過增強機體的免疫力,多方位抗擊病毒感染，使病毒對其難以產生耐藥性，其次中藥治療呼吸道感染時毒副作用較輕、治愈溫和、資源豐富，價格低廉，這正是中藥抗病毒所具有的獨特優勢。

清熱藥的研究歷史悠久,藥理作用廣泛，大量的研究表明,清熱藥具有解熱、抗炎、抗病原微生物作用、調節免疫功能及抗腫瘤等多種藥理作用，因其具有較強的抗病毒活性逐漸受到重視。近年來，國內外對清熱藥抗病毒作用進行了篩選，在實驗和臨床研究中都有很大進展，但是清熱藥抗 RSV 的研究仍集中在單味中藥抑制病毒增殖或調節機體的免疫應答方面,且作用機理尚不清晰;研究思路多效仿西藥模式,缺乏中醫藥理論的指導；實驗研究處于細胞水平，與臨床用藥相脫節。

因此，在清熱藥抗RSV的篩選中，我們應該除了從單味藥著手外，也應對復方制劑、拆方、中藥有效成分、多種有效成分聯合應用等多個方面進行研究，為研發抗RSV的新劑型提供參考條件；其次調整抗病毒機理研究方向，如用含藥血清為樣品,模擬藥物代謝的體內過程,使結果與臨床用藥特點更相近；可深入研究清熱藥抗RSV作用機制,為快速尋找安全有效、特異性針對RSV感染的高效能中藥作出貢獻。