重慶地區心腦血管疾病氯吡格雷抵抗與CYP2C19基因多態性等影響因素研究*

殷 勤，黃 慶，羅中蘭，臧 婉，王麗馨

（陸軍軍醫大學大坪醫院·野戰外科研究所檢驗科，重慶 400042）

氯吡格雷是繼阿司匹林后的心腦血管患者常用抗血小板聚集抑制劑，是一種藥物前體，在肝臟生物氧化成2-氧基-氯吡格雷，再水解成具有生物活性的物質［1］，起到抑制血小板聚集的作用。除了患者年齡、性別存在差異外，吸煙、糖尿病、高血脂、遺傳、炎性因子等都是影響氯吡格雷藥效的因素，起決定性作用的是人群中基因型別的多態性［2］，遺傳因素是所占比重最大的影響因素［3］。CYP2C19基因的研究重點在于抗抑郁藥、質子泵抑制劑和心血管類藥物（如氯吡格雷）的個體反應差異［4-5］。目前，將服氯吡格雷后用血二磷酸腺苷（ADP）誘導的最大血小板聚集率較基線水平下降≤10%定義為氯吡格雷抵抗（CR）［6］。本研究中探討了 CYP2C19 基因多態性、超敏急性時相反應蛋白（CRP）、凝血時間（TT）、血糖、性別和年齡等高危因素對氯吡格雷反應性的影響，檢測服用氯吡格雷治療前后的心腦血管疾病患者的血小板聚集率差值，評估是否存在CR。現報道如下。1 資料與方法

1.1 研究對象

納入標準：重慶地區無血緣關系的漢族；年齡29～90歲；臨床診斷心腦血管疾病；服用氯吡格雷片抗凝治療（賽諾菲杭州制藥有限公司，規格為每片75 mg）75 mg／d。

排除標準：抗血小板治療禁忌證，血小板＜100或＞45×109／L；氯吡格雷過敏或不耐受；住院前服用氯吡格雷或華法林，或使用過其他Ⅱb／Ⅲa受體拮抗藥；嚴重肝腎功能損害（血轉氨酶超過正常值2倍以上，血肌酐＞177 mmol／L），嚴重心力衰竭或左室射血分數＜30%；凝血功能障礙，半年內有卒中或出血性疾病，近期有出血史、輸血史或肝素誘發血小板減少癥；近期擬行外科手術，或介入治療禁忌證；惡性腫瘤。

收集資料：前瞻性納入我院神內科2017年6月至2018年8月需服用氯吡格雷常規治療的心腦血管疾病患者526例，其中男317例，女209例。

1.2 基因型檢測

應用血液DNA提取試劑盒（上海百傲生物科技股份有限公司）。樣本處理：抽取2 mL靜脈血，置EDTA抗凝管中上下顛倒混勻，DNA，CYP2C19基因引物由Primer 3軟件生成。擴增條件：50℃，5 min；94 ℃，5 min；94 ℃，25 s；48 ℃，40 s；72 ℃，30 s。共 35 個循環，72 ℃延伸5 min。將擴增產物置1.5%瓊脂糖中進行凝膠電泳，應用凝膠成像系統掃描電泳條帶，并進行分析。

基因型別包括野生型CYP2C19*1／*1；突變雜合型 CYP2C19*1 ／*17，CYP2C19*17 ／*17，CYP2C19*2 ／*17，CYP2C19*3 ／*17，YP2C19*1 ／*2，CYP2C19*1 ／*3；突變純合型 CYP2C19*2 ／*2，CYP2C19*2 ／*3，CYP2C19*3 ／*3。根據不同基因型別所編碼的酶對氯吡格雷的代謝速率，將CYP2C19*17／*17，CYP2C19*1／*17 歸 為 超 快 代 謝 型 ；CYP2C19*1／*1 為快代謝型；CYP2C19*2／*17，CYP2C19*3 ／*17，CYP2C19*1 ／*2 和 CYP2C19*1 ／*3 為中代謝型；CYP2C19*2 ／*2，CYP2C19*2 ／*3，CYP2C19*3／*3為慢代謝型。

1.3 血小板聚集率測定

分別于服用氯吡格雷前和服用75 mg氯吡格雷24 h后抽取靜脈血，分別測定靜脈血ADP誘導的最大血小板聚集率（MAP），其中ADP、海倫娜血小板聚集儀均為美國海倫娜實驗室Helena Laboratories產品。以100g離心12 min、1 600g離心5 min血漿分別制備富、乏血小板血漿，分別各取225，250 μL，富血小板血漿加入濃度為50 μmol／L ADP試劑，采用比濁法檢測血小板聚集抑制率。血小板聚集抑制率＝治療前后血小板聚集率差值／治療前血小板聚集率×100%。血小板聚集抑制率≤10%稱為 CR，＞10%稱為“氯吡格雷敏感”［7］。

1.4 CRP測定

深圳普門特定蛋白分析儀PA-990，EDTA抗凝服用氯吡格雷24 h后抽取靜脈血2 mL，采用超敏急性時相反應蛋白試劑盒（散射比濁法）檢測CRP。

1.5 凝血時間測定

TOP-700型全自動血凝儀（Beckman公司），Instumentation Laboratory 試劑 Thrombin Time，3.2% 枸櫞酸鈉抗凝，服用氯吡格雷24 h后抽取靜脈血2.7 mL，2 h內檢測。

1.6 空腹血糖（FBG）測定

DXC800型全自動生化儀（Beckman公司），Beckman試劑，服用氯吡格雷24 h后抽取靜脈血3 mL，自然凝固析出血清，4 000 r／min離心后2 h內完成檢測。

1.7 統計學處理

采用SPSS16.0統計學軟件分析。計量資料用表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，如有差異再用t檢驗進行兩兩比較；計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CYP2C19基因型和代謝型分布情況

526例患者檢測出的基因型包括野生型CYP2C19*1 ／*1；突變雜合型 CYP2C19*1／*17，CYP2C19*2 ／*17，CYP2C19*3 ／*17，YP2C19*1 ／*2，CYP2C19*1 ／*3；突變純合型 CYP2C19*2／*2，CYP2C19*2／*3；沒有出現突變純合型CYP2C19*17 ／*17，CYP2C19*3 ／*3。根據不同基因型別所編碼的酶對氯吡格雷的代謝速率分型，超快代謝型占0.95%（n＝5），快代謝型占 40.49%（n＝213），中代謝型占 43.73% （n＝230），慢代謝型占 14.83% （n＝78）。男性和女性的CYP2C19基因型及代謝型在分布上差異顯著（P＜0.05）。詳見表 1。

2.2 高危因素CYP2C19基因多態性的影響

根據不同基因型所產生的代謝類型進行分組，對納入研究的526例患者行血糖、CRP、TT、性別和年齡等方面比較，高危因素與其代謝類型在發生性別上有一定差異，但無統計學意義（P＞0.05）。

表1 CYP2C19基因分布情況（n＝526）

2.3 CYP2C19基因型代謝型與CR發生率的關系

526 例患者中，發生 CR 73 例（13.88%），超快、快、中、慢代謝型4組患者中發生CR的例數分別為0例、26 例（12.21% ）、33 例（14.35% ）、14 例（17.95% ），其分布的差異有統計學意義（P＜0.05）。與超快代謝組、快代謝組相比，中代謝組和慢代謝組CR發生率更高，差異有統計學意義（P＜0.05）。另外，相比中代謝組，慢代謝組CR發生率更高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 不同代謝型患者服藥前后血小板聚集率的變化

應用氯吡格雷治療前，4組用50 μmol／L ADP誘導的不同代謝型患者血小板聚集率基礎值差異無統計學意義（P＞0.05）。服用75 mg負荷量氯吡格雷24 h后，4組患者血小板聚集率較服藥前降低幅度差異均有統計學意義（P＜0.05）。超快代謝組、快代謝組、中代謝組分別與慢代謝組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。超快代謝組、快代謝組、中代謝組組間兩兩比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。詳見表 2。

表2 各組患者應用氯吡格雷治療前后血小板聚集率變化比較（±s，% ）

表2 各組患者應用氯吡格雷治療前后血小板聚集率變化比較（±s，% ）

組別超快代謝組快代謝組中代謝組慢代謝組用藥前75.6 ±9.4 77.3 ±11.2 76.8 ±10.1 75.5 ±7.7用藥后55.5 ±10.4 55.4 ±13.0 54.2 ±11.6 62.1 ±9.5血小板抑制率26.6±18.3 28.3±19.1 29.4±17.0 17.7±13.3

3 討論

本研究中CR發生率為13.88%，與文獻［5］報道的發生率4%～31%一致。氯吡格雷的抗血小板聚集作用受多種因素的影響，包括遺傳、藥物、劑量、炎性因子等，其中遺傳因素占比最高［8］，且遺傳在CR中的作用逐漸被重視［9-10］。具有遺傳多態性的CYP2C19酶的SNP位點的差異體現在種族和地區的分布［11］，且個體間酶的活性也存在顯著不同，正是這種差異性，可能會導致某些藥物（如氯吡格雷）在機體的代謝能力存在民族、地區差異［12］。將氯吡格雷治療后血小板聚集率≥60% 定義為殘余血小板高反應性（HTR）［13］。HTR 必然增加心血管疾病的發生風險［2］。

我國漢族人群的CYP2C19基因呈多態性，CYP2C19基因突變的類型主要為CYP2C19*2和CYP2C19*3位點，且我國人群發生CYP2C19*2位點突變的比例較*3位點高［14］。這一結論與亞洲其他地區人群的基因多態性一致［15］。引起氯吡格雷的酶活性降低的也是CYP2C19*2或*3位點突變，與遺傳相關，亞洲人99%以上是CYP2C19*2或*3突變。CYP2C19基因的主要突變體是CYP2C19*2，在氯吡格雷抗血小板聚集作用機制起決定因素［16］。我國患者的CYP2C19*2突變多態性與血小板聚集率密切相關［17］，這就是與CR密切相關的根本原因。*2突變是CR的危險且獨立因素［18］。攜帶CYP2C19*2基因突變位的個體具有更高的血小板活性，對氯吡格雷的代謝活性較野生型顯著降低［6］，使其最大血小板聚集率下降較少，導致CR風險增高。與CYP2C19*2基因不同，攜帶*3基因是發生CR的預測因素［3］。CYP2C19*3位點突變僅有雜交型［19］，與研究結果中未出現 CYP2C19*3 ／*3基因型的結論一致。本研究中，CYP2C19（*2及*3位點）基因的純合突變率為14.83%，與文獻［20］報道接近。CYP2C19*17等位基因的突變，是氯吡格雷在體內的活性遺傳調控因子［21］，CYP2C19*17基因與*2和*3基因的作用相反，攜帶*17基因的個體服用氯吡格雷后，能提高對血小板聚集的抑制率［22］，從而不易發生CR［23］，同時必然增加了出血風險［24］。攜帶 CYP2C19*17基因的患者被劃為氯吡格雷代謝的超快代謝組，顯著抑制血小板聚集活性［25］。

本研究結果顯示，基因型為CYP2C19*1／*1的野生型比例為40.49%，與國內漢族人群CYP2C19基因多態性研究中，野生型比例為 42.4% （120 ／283）［26］的結果非常一致。本研究結果還顯示，男女性基因型比較，差異無顯著性，說明性別在重慶地區CYP2C19基因多態方面無明顯影響。

本研究中還試圖分析多種心血管病的高危因素（如炎性因素C反應蛋白、高血糖、凝血時間、性別、年齡等）以找出與CR的相關性，但結果顯示，高危因素與其代謝類型在性別上有一定差異，可能與納入人群數量在性別方面的分布有關系，但未發現與CR的發生有顯著關聯性。