膜性腎病患者臨床病理特點及外周血T及Th細胞亞群分析

(保定市第二中心醫院1.血液腎病科，2.血透室，河北 保定072750)

膜性腎病是原發性腎小球腎炎中最常見的病理類型，近年來發病率呈逐年上升趨勢[1]。流行病學研究顯示，約30%的膜性腎病患者5年內病情自行緩解，70%的患者表現為持續性蛋白尿，半數以上的患者8～12年發展為終末期腎病[2]。免疫抑制劑是目前治療膜性腎病的主要方案，但由于膜性腎病患者病情轉歸的不同，導致免疫抑制劑的應用存在較大爭議[3]。準確評估膜性腎病患者臨床病理特點及免疫功能狀況，篩選出可能進入終末期腎病的患者，對治療方案的選擇具有重要意義。本研究根據24 h蛋白尿、血清白蛋白水平將膜性腎病患者分為中高危組、低危組，分析病理分期、腎小球球性硬化、IgG等病理特點；并以健康志愿者為對照，分析T及Th細胞亞群水平，旨在為膜性腎病治療方案的選擇及免疫失衡機制的闡明提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2017年6月至2018年10月間本院收治的膜性腎病患者100例。入選標準[4]：①年齡≥18歲，經腎組織活檢確診為膜性腎??；②無環磷酰胺、糖皮質激素、環孢素等免疫抑制劑或細胞毒性藥物服用史。排除標準[5]：①合并自身免疫性疾病、過敏性哮喘；②合并感染性疾病、惡性腫瘤、嚴重心腦血管疾?。虎垩◆?309 μmol/L，或合并威脅生命的腎病綜合征并發癥。根據24 h蛋白尿、血清白蛋白水平分為中高危組(24 h蛋白尿≥4 g，血清白蛋白≤20 g/L)78例，低危組(24 h蛋白尿<4 g，血清白蛋白>20 g/L)22例。高危組中男性54例，女性24例；年齡26～65歲，平均年齡(48.59±12.64)歲。低危組中男性17例，女性5例；年齡24～68歲，平均年齡(49.02±11.90)歲。選取同期體檢的健康志愿者66名為對照組，其中男性56例，女性10例；年齡25～62歲，平均年齡(48.85±12.03)歲。三組受試者性別、年齡之間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經倫理委員會批準，受試者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 腎組織病理指標檢測 ①光學顯微鏡觀察：取腎活檢組織，10%甲醛固定后常規石蠟包埋，4 μm連續切片，分別行HE染色、過碘酸六胺銀染色、過碘酸-雪夫反應、Masson染色；光學顯微鏡下觀察病理分期、腎小球球性硬化、腎小球節段硬化、新月體、間質炎性細胞浸潤、腎小管急性病變區[6]。②免疫熒光檢測：取腎組織進行冰凍直接切片，5%胎牛血清封閉20 min，磷酸緩沖液洗滌，滴加鼠抗人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單克隆抗體，均為1∶500稀釋，37 ℃孵育2 h，滴加山羊抗鼠IgG，1∶1 000稀釋，37 ℃孵育40 min，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2 外周血單核細胞分離 收集受試者空腹肘靜脈血4 mL，抗凝處理后與5 mL DMEM培養基混合均勻，加入淋巴細胞分離液，3 000 r/min離心30 min，吸取上層與中層交界處的外周血單核細胞，加入10 mL DMEM培養基，2 000 r /min離心10 min，除去淋巴細胞分離液；用含10%胎牛血清的DMEM培養基重懸細胞，計數后調整細胞濃度為1×106/mL，分裝入流式細胞管中保存待用，每管中細胞數為1×106個。

1.2.3 外周血單核細胞中Th細胞亞群檢測 取10 μL外周血單核細胞懸液，滴加10 μL 0.2%臺盼藍計數，光學顯微鏡下觀察細胞活性并計數；余下的外周血單核細胞懸液以2 000 r/min離心10 min，收集細胞，使用DMEM完全培養基重懸細胞并調整細胞密度為1×106個/mL于流式細胞管中。設置同型對照管、試驗管，每管中加入5 μL anti-CD4 (FITC)，室溫下避光靜置30 min，磷酸緩沖液洗滌后，2 000 r/min離心10 min，去除上清，滴加600 μL固定和透化溶液(Fixation/Permeabilization Solution)，避光反應30 min；加入5 mL配制好的BD Perm/Wash洗滌、2 000 r/min離心后去除上清，向試驗管中滴加5 μL的anti-IFN-γ-FITC、anti-IL-9-PE、anti-IL-4-APC，同型對照管中滴加anti-IgG1-PE、anti-IgG1-APC各2 μL，避光反應40 min，多聚甲醛固定后上流式細胞儀檢測。

1.2.4 外周血中T細胞檢測 設置同型對照管、試驗管，分別取400 μL抗凝處理后的肘靜脈血，均加入Anti-CD4 (PerCP)、Anti-CD25 (APC)各10 μL，室溫下避光反應30 min；每個流式細胞管中分別加入溶血素3 mL，避光靜置20 min，加入1 mL磷酸緩沖液洗滌，2 000 r/min離心10 min，去除上清，加入1 mL Fixation/Permeabilization Solution固定、通透，避光靜置90 min，加入2 mL的Permeabilization Buffer，2 000 r/min離心10 min，去除上清，滴加Anti-FOXP3-PE 10 μL，同型對照管滴加Anti-IgG-PE 10 μL，室溫下避光反應30 min，多聚甲醛固定后上流式細胞儀檢測。

1.3 統計學分析

數據以均數±標準差、百分比表示，進行方差分析、t檢驗、χ2檢驗，使用SPSS21.0處理，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組患者病理檢查指標比較

間質炎性細胞浸潤、腎小管急性病變區在中高危組與低危組之間差異有統計學意義(P<0.05)，中高危組間質炎性細胞浸潤、腎小管急性病變區范圍明顯大于低危組。病理分期、腎小球球性硬化、腎小球節段硬化、新月體在兩組患者間差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。電鏡下可見兩組患者腎小球基底膜均增厚，上皮下及系膜區有電子致密物沉積。見圖1。

2.2 各組患者IgG不同亞型沉積情況分析

膜性腎病患者中IgG4熒光強度最高，IgG2熒光強度最弱，見圖2。同一患者IgG不同亞型中熒光強度最強定義為IgG亞型主沉淀。中高危組患者中IgG4為主沉淀的比例最高，且明顯高于低危組(P<0.01)；低危組患者中IgG1主沉淀的比例最高，且明顯高于中高危組(P<0.01)；低危組患者中IgG2、IgG3主沉淀的比例明顯高于中高危組(P<0.05)。見表2、圖2。

表1 中高危組與低危組患者病理檢查指標比較 (例,%)

圖1 電鏡下觀察腎小球基底膜增厚(15000×)

表2 各組患者IgG亞型主沉積情況比較 (例,%)

圖2 兩組患者免疫熒光IgG不同亞型沉積情況

2.3 各組患者外周血T及Th細胞亞群情況分析

T細胞亞群中CD3+CD45+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+在各組間差異有統計學意義(P<0.05)；中高危組和低危組CD3+CD45+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+明顯高于對照組(P<0.05)。Th細胞亞群中Th9、Th1、Th2、Th2/Th9在各組間差異有統計學意義(P<0.05)；Th9、Th1、Th2水平明顯高于對照組，Th2/Th9明顯低于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 各組患者外周血T及Th細胞亞群情況分析

與對照組比較，aP<0.05；與低危組比較，bP<0.05

3 討 論

膜性腎病是最常見的原發性腎小球腎炎之一，發病率僅次于IgA腎病[7]。膜性腎病患者的臨床自然轉歸存在較大差異，準確評估患者病理特點及免疫情況，預測可能發展為終末期腎病的高?；颊?，對臨床治療方案的制定具有重要意義。本文根據24 h蛋白尿及血清白蛋白水平將膜性腎病患者分為中高危組、低危組，比較臨床病理特點。結果顯示，膜性腎病患者病理分期以Ⅱ期為主，但中高危組與低危組之間無明顯差異。相關研究顯示，高齡、高血壓、腎功能減退的膜性腎病患者病理分期較高[8]。目前膜性腎病分期與癥狀及實驗室指標間的關系仍存在較大爭議，需進一步大樣本量深入研究。中高危組間質炎性細胞浸潤、小管急性病變區的范圍均明顯高于低危組，提示尿蛋白量越大，膜性腎病患者腎臟急性和慢性病變程度越嚴重；根據蛋白尿分級可用于膜性腎病預后評估。IgG包括4種亞型，其中IgG4與膜性腎病的發生與發展關系最明顯,研究者發現，IgG4是抗磷脂酶A2受體抗體與1型血小板反應蛋白7A域的特異性抗體，是鑒別特發性膜性腎病與繼發性膜性腎病的主要標志物。膜狼瘡性腎炎存在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4高表達[9]。本研究以特發性膜性腎病患者為研究對象，IgG亞型中以IgG4熒光強度最高，IgG2熒光強度最弱。中高危組以IgG4為主要亞型沉積，低危組以IgG1為主要亞型沉積。研究者發現，膜性腎病不同發病期的主要IgG亞型沉積存在差異，發病早期以IgG1為主要沉積[10]，而IgG4通過經典途徑對補體的激活能力弱，早期水平偏低，發病晚期在腎小球皮下沉積[11]。

正常狀態下T細胞亞群可維持一定數量和比例，機體免疫功能處于正常狀態；當T細胞亞群之間平衡失調會引發細胞因子分泌異常，導致免疫失調[12-13]。本研究顯示，中高危組患者CD3+CD4+、CD4+/CD8+水平明顯高于對照組，且CD3+CD8+呈下降趨勢，與相關研究報道一致[14]；提示膜性腎病患者外周血T細胞亞群以CD4+T細胞水平升高為主，CD4+/CD8+比值增加。但上述改變也存在于IgA腎病[15]，因此CD4+/CD8+變化不能作為膜性腎病的特異性表現。研究者對IgA腎病患者外周血Th1、Th2研究顯示，Th2水平明顯提升，且與24h蛋白尿呈正相關，但Th1未出現明顯改變，存在Th1/Th2平衡失調[16]。之后研究者從膜性腎病患者外周血單個核細胞中分離純化得到B細胞，與IL-4、IL-10等細胞因子在體外進行共培養，酶聯免疫吸附法檢測IgG亞型發現B細胞與Th2分泌的IL-4共培養后，IgG4較其他研究組明顯提升[17]。亦有研究者對ANCA相關性腎炎、膜性腎病患者的腎組織行RT-PCR檢測顯示，IL-4 mRNA主要沉積于膜性腎病，且與IgG4呈正相關[18]。上述研究分別從體外分離細胞和腎組織層面上證實了膜性腎病主要以Th2細胞反應為主，進而促進IgG4分泌。本研究中膜性腎病患者外周血Th1、Th2細胞因子均明顯低于正常對照組，且Th1/Th2呈下降趨勢，低危組趨勢最明顯；與相關研究報道一致[19]；提示膜性腎病患者存在Th1/Th2平衡失調。以往對腎病患者的研究多集中于CD4+/CD8+、Th1/Th2，對Th9的研究較少[20-21]。Th9具有多種生物學活性，與Th細胞亞群相關，其中與Th2關系最明顯[22]。本研究顯示，膜性腎病患者外周血Th9明顯高于對照組，且中高危組明顯高于低危組，膜性腎病患者Th2/Th9明顯低于對照組。提示膜性腎病患者存在Th9細胞反應，且Th2向Th9偏移，Th9過表達與膜性腎病發展有關。