PRF對糖尿病大鼠創面Wnt/β-catenin信號通路的影響

卓 然 王 楊 劉 剛 章登輝 龔 慧

我國糖尿病患者已超過1億人，大約30%的患者會發生皮膚破潰，由于局部神經和血管病變，糖尿病潰瘍常反復發生，難以愈合，嚴重者可因重度感染危及生命[1]。雖然目前治療糖尿病的方案眾多，但總體治療效果并不理想。孫曉磊等[2]研究表明糖尿病大鼠β-catenin表達降低，表皮細胞增殖能力下降，故認為Wnt/β-catenin信號轉導紊亂與糖尿病創面難以愈合有關。富血小板纖維蛋白(PRF)是一種富含細胞因子和生長因子的自體來源的新型生物材料，Ding等[3]報道其可有效促進糖尿病大鼠皮膚創面愈合。但是PRF促進糖尿病創面愈合是否與Wnt/β-catenin信號通路的轉導有關鮮有報道。因此，本研究通過檢測創面不同時間點β-catenin的表達水平，探索PRF對糖尿病創面愈合Wnt/β-catenin信號通路的影響。

材料與方法

1.實驗動物:40只8周齡雄性SD大鼠購于遼寧長生生物公司/遼寧何氏醫學院[許可證號：SCXK(遼)2015-0001，合格證號：211002300035410]，體重200～230g，平均體重218±3.57g。在標準環境下給予高脂高糖飼料喂養4周，健康狀態良好后用于實驗。

2.主要試劑與儀器設備：(1)主要實驗試劑：鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)、枸櫞酸鈉緩沖液(美國索萊寶公司，貨號：C1013)、DAB顯色試劑盒(福州邁新生物公司，批號：1805300031)、大鼠SP超敏試劑盒(福州邁新生物公司，批號：1805159710)、β-catenin一抗(美國Proteintech公司，批號：60008-1)、PBS磷酸鹽緩沖液(福州邁新生物公司，批號：18052202)、抗原修復緩沖液(福州邁新生物公司，批號：18042404)。(2)主要實驗儀器：電子天平(中國上海精密公司)、羅氏活力血糖儀及試紙(德國羅氏公司)、石蠟切片機(德國徠卡Leica)、75℃恒溫烤箱(中國福意公司)、光學顯微鏡(德國Lioo公司)、臺式離心機(中國吉迪儀器公司)、未加抗凝劑的玻璃采血管、透明網格紙。

3.實驗方法：(1)糖尿病大鼠模型建立：大鼠禁食12h，腹腔注射1%鏈脲佐菌素溶液45mg/kg，1周后于尾靜脈測空腹血糖值。若空腹血糖值≥16.7mmol/L，則視為造模成功；若血糖值<16.7mol/L，則視為不成功，以劑量為30mg/kg的鏈脲佐菌素再次誘導，如仍不成功則剔除實驗[4]。(2)糖尿病大鼠創面的制備：所有大鼠均以1%的水合氯醛(300mg/kg)進行腹腔注射麻醉，麻醉后用10%的硫化鈉去除大鼠背部及側腹部毛發。用邊長22mm的正方形硬紙板及標記筆在大鼠脊柱兩側各做一正方形標記，造模前常規消毒，使用無菌手術剪及手術鑷沿標記線剪出一邊長22mm的正方形缺損(面積為484mm2),創面深達淺筋膜層，此即為糖尿病大鼠創面模型。(3)PRF制備:用未加抗凝劑的真空采血管抽取8位志愿者的靜脈血，迅速置于離心機中，立即以3000r/min的速度離心10min。離心后試管內血液分為3層，PRF位于底層深紅的紅細胞碎片和頂層淡黃色的貧血小板血漿澄清液之間，呈淡黃色凝膠狀。用無菌注射器針頭取出采血管內凝膠條，修剪并保留PRF尾部少許紅細胞成分，即制備完成(圖1A、圖1B)。(4)分組及干預：選擇大鼠左側創面做為PRF組，右側創面為對照組。將制備的PRF膜片置于大鼠左側創面上，凡士林紗布覆蓋兩側創面后，無菌紗布包扎(圖1C)。每只大鼠均單籠飼養并依次編號，換藥時各創面均用1%碘伏消毒再以無菌紗布擦干后常規包扎。創面每日換藥1次，分別于操作后的3、7、14天使用隨機數字表法挑取大鼠注射過量麻藥處死并取創緣3mm內皮膚組織做進一步檢查。

圖1 PRF制備及應用A.血液離心后；B.PRF凝膠；C.PRF覆蓋創面

4.觀察創面愈合情況：(1)創面面積及愈合率：術后即刻及3、7、14天采集創面照片，拍照時用刻度尺測量創面橫軸及縱軸長度，并用透明網格紙沿創面邊緣繪制創面圖形，拍取照片后用Image J軟件計算創面未愈合面積。愈合率計算公式為：愈合率=(創面原始面積-未愈合面積)/創面原始面積×100%。(2)HE染色：術后3、7、14天取創緣組織置于4%甲醛溶液中固定，常規石蠟包埋、切片，脫蠟水化后蘇木素、伊紅染色。光鏡下選取5個200倍視野，觀察創面炎性反應，并用圖像分析軟件測肉芽組織厚度。(3)SP免疫組化染色：根據SP免疫組化步驟進行β-catenin的染色。光鏡下細胞質呈棕色為β-catenin陽性，每張切片隨機選取5個不重復的視野(×400倍)，計數100個細胞中的陽性細胞個數，取平均值作為陽性細胞的表達率。

結 果

1.糖尿病大鼠成模情況:40只大鼠經腹腔注射STZ后，逐漸出現多飲、多食、多尿、毛發無光澤、精神萎靡、活動減少、蜷臥拱背等癥狀。大鼠腹腔注射STZ 1周內共死亡4只，且主要集中在注射STZ后第3天。第1次注射STZ后共有16只大鼠空腹血糖值低于16.7mol/L，16只大鼠經補注STZ后共死亡1只，1周后測空腹血糖小于16.7mol/L的共5只，給予剔除實驗。故經腹腔注射STZ后共計篩選出造模成功的糖尿病大鼠30只，體重180～210g，平均體重193±4.52g，較造模前體重有所減輕。隨后的實驗中無大鼠異常死亡。

2.兩組創面愈合情況：造模后第3天，創面干燥、色澤紅潤，較少分泌物；PRF組與對照組創面愈合率比較差異無統計學意義(22.1%±4.2% vs 20.5%±4.9%，t=1.358，P=0.180)。7、14天可見肉芽組織生長活躍、呈紅色、創緣形狀不規則，收縮與上皮化現象明顯；PRF組創面愈合率均明顯高于對照組，差異有統計學意義(68.7%±10.6% vs 46.6%±9.2%，83.7%±2.2% vs 72.1%±3.4%，t=7.042、9.058，P均=0.001)，詳見圖2。

圖2 術后不同時間點兩組創面大體觀

3.兩組創面HE染色的比較：造模后第3天，兩組創面均可見大量中性粒細胞浸潤，周圍組織水腫明顯，但PRF組肉芽組織水腫程度較對照組輕，肉芽組織厚度差異有統計學意義(1054±107 vs 1350±112，t=-6.043，P=0.001)。造模后第7、14天，PRF組中性粒細胞浸潤程度減輕明顯，伴有毛細血管增生，周圍組織水腫減輕，肉芽組織結構致密，與對照組比較差異有統計學意義(523±102 vs 1128±127，569±118 vs 682±124，t=-11.745、-2.272，P=0.001、0.036)，詳見圖3。

圖3 術后第14天兩組創面(HE，×200)A.PRF組；B.對照組

4.兩組創面β-catenin染色的比較：造模后第3、7、14天，兩組創面均出現細胞質粗細不一的棕黃色陽性著色顆粒，但PRF組陽性細胞計數明顯多于對照組，差異有統計學意義(39.2±7.8 vs 23.6±6.2，44.5±6.8 vs 25.8±5.8，44.9±5.5 vs 25.6±6.1，t=4.951、6.616、7.431，P均<0.05)，詳見圖4。

圖4 術后第14天兩組創面β-catenin(免疫組化,×400)A.PRF組；B.對照組

討 論

糖尿病創面難愈的具體機制尚不完全清楚，目前認為其與皮膚的特殊微環境、體內免疫應答功能障礙及相關細胞因子數量的改變有關，任何一個環節發生障礙均可使創面愈合延遲[5]。然而糖尿病患者又易于發生皮膚破潰，糖尿病人群中足部潰瘍年發生率為8.1%，年截肢(趾)率為5.1%，長期的治療費用以及較差的預后效果極大的影響了患者的生存質量，因此有必要探索新的治療手段，使創面的治療方案多元化[6]。

PRF是一種富含細胞因子和生長因子的自體來源的新型生物材料，其促進創面愈合主要通過3個方面實現，分別為細胞因子的調節作用、纖維蛋白的支架作用及白細胞的免疫調節作用[7, 8]。首先，PRF含有多種生長因子，主要類型有血管內皮細胞生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、轉化生長因子(TGFβ-1)、血小板衍生生長因子(PDGF-AB)和表皮生長因子(EGF)。這些生長因子能夠調節蛋白質表達及成纖維細胞增殖，促進創傷愈合、組織修復。有研究表明β-catenin能夠通過調節TGF-β1來誘導成纖維細胞轉化，尤其是皮膚成纖維細胞[9]。其次， PRF凝膠組織具有疏松、孔隙大、彈性好的特性，其結構與人類天然的組織結構非常相似。這一特性有利于組織在修復過程中發揮細胞支架作用；有利于營養物質和氧氣彌散至細胞周圍；有利于誘導細胞移動和增殖[10]。最后，PRF中滯納了大量白細胞，其在離心過程中被激活，在PRF降解過程中可不斷釋放免疫調節相關的細胞因子，發揮抗感染的作用[11]。因此，PRF對糖尿病創面具有一定的療效。

引起糖尿病創面的機制眾多，信號通路轉導的變化是其中之一。Wnt/β-catenin信號通路具有高度的保守性，其與皮膚發育、創傷愈合關系密切， 表達增強時可促進皮膚表皮細胞、角質細胞、成纖維細胞及血管內皮細胞增殖、分化[12, 13]。正常情況下沒有Wnt信號的傳入，胞質內的β-catenin在絲氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化下進行降解，從而不發生表達。當有Wnt信號傳入時，β-catenin由于不能被磷酸化降解，在胞質中積累到一定程度后轉移到細胞核，激活Wnt靶基因的轉錄，從而激活該通路[14]。Chen等[15]研究表明β-catenin信號轉導與皮膚發育、創傷愈合關系密切，可參與真皮和表皮結構的形成。Xu等[16]研究表明在創面修復過程中，β-catenin信號轉導被激活并參與上皮的再生，提高了表皮細胞的增殖和遷移能力。

本研究揭示了PRF對糖尿病大鼠創面愈合情況及對Wnt/β-catenin信號通路的影響。本實驗在術后不同時間點記錄并計算出創面面積。通過分析認為7～14天PRF組大鼠創面愈合率明顯高于對照組，初步表明了PRF可以有效促進糖尿病大鼠創面的愈合。HE染色顯示PRF組中性粒細胞浸潤明顯減輕，肉芽組織結構更加致密。SP免疫組化示PRF組β-catenin陽性表達細胞數量高于對照組，提示了PRF能夠干擾Wnt/β-catenin信號通路的轉導，使其表達水平升高，這一結果與相關文獻報道一致。

綜上所述，PRF中多種生長因子的協同作用以及立體網狀結構和免疫調節作用使其在糖尿病創面治療中具有獨特的優勢。本研究表明，PRF能夠有效促進糖尿病大鼠創面愈合，其作用機制與提高Wnt/β-catenin信號通路的轉導有關。