CVA10致手足口病的流行情況與疫苗研究進展

高微捷 岳 磊 謝忠平

手足口病(hand，foot，and mouth disease，HFMD)是由多種腸道病毒引起的一類常見的急性傳染病，多發生于5歲以下兒童，主要經糞-口途徑傳播。感染某種腸道病毒而導致手足口病，無論是顯性感染還是隱性感染，都能夠獲得相對應的特異性免疫力，且產生的抗體可在體內存留較長時間[1]。柯薩奇病毒A組10型(CVA10)是近幾年除EV71、CVA16和CVA6外，又一個引起全球范圍內手足口病散發或暴發的病毒。日本、美國、新加坡、西班牙、芬蘭、印度、法國、泰國等國家，以及中國河北、山東、福建、湖北、河南、廣東等省份，均發生了不同程度的CVA10流行。筆者認為應該更加關注CVA10感染所致疾病以及CVA10疫苗的研制。

一、CVA10致手足口病的流行概況

1.CVA10致手足口病的臨床表現：不同病毒感染引起的手足口病臨床表現也略有差異。EV71感染的患兒臨床表現常累及神經系統，同時還伴有嚴重的并發癥；CVA16感染的患兒臨床癥狀相對較輕，常為自限性疾病，預后較好，神經系統受累較輕，但會有心肌受損出現；CVA6感染的患兒主要表現為發熱、皮疹和脫甲癥[2，3]。CVA10感染后，一般只引起輕度和自限性疾病癥狀，如發燒、口腔潰瘍、手腳上的皮疹或水皰疹等，也會發生如指甲脫落、皰疹性咽峽炎、甲狀腺腫瘤、神經脊髓炎、腦膜炎、心肌炎等嚴重的手足口病并發癥，或者出現死亡[4]。曾有報道稱，日本發現1例因患脊髓灰質炎綜合征而死亡的患者，血清學鑒定為CVA10感染[5]。

2.CVA10致手足口病的流行病學概況：國外曾報道過CVA10感染而導致手足口病暴發的事件。2005年，日本愛知縣發現由腸道病毒引起的皰疹性咽峽炎病例64例，在對這些患者的糞便和咽拭子標本進行腸道病毒基因檢測時發現，病毒核酸陽性率達46.9%(30/64)，進一步的基因測序分析表明，在30份核酸陽性標本中，19份檢測為CVA10，占比63.3%。該研究結果表明，CVA10是導致2005年愛知縣皰疹性咽峽炎的主要病原體[6]。根據美國2006年的統計，CVA10血清型是最常報道的15種造成手足口病的腸道病毒血清型之一(第15位)，占比為1.4%[7]。2007年,日本神奈川縣從46份以皰疹性咽峽炎為主要癥狀的患者的咽拭子標本中，分離出14 株CVA10分離株[8]。2008年，新加坡發生手足口病流行，經檢測分析，由CVA10導致的手足口病占全部病例的11.8%[9]。2008年6月，西班牙瓦倫西亞發生手足口病疫情，被感染的患兒都不同程度地發生指甲脫落癥狀，并且從這些患兒的標本中分離出CVA10，分離率為49%[10]。2008年秋季，芬蘭發生了全國性的手足口病疫情，相當數量的臨床診斷患者為成年人，許多患者在手足口病急性期幾周后同樣也出現指甲脫落癥狀，在從患者標本中分離病毒時發現，28%的致病原體為CVA10[11]。2009～2010年，印度檢測到CVA10的致病率為2.4%[12]。2010年4～12月份，法國出現手足口病，且CVA10的分離率為39.9%，調查發現，在4～7月份這段時間里，CVA10是分離最多的導致手足口病的病原體，達到了47.9%，患兒年齡集中在0～4歲[13]。2012年，在泰國發現的手足口病中，CVA10的分離率為1.1%[14]。詳見表1。

表1 CVA10致手足口病的國外流行病學概況

自2008年起，手足口病開始在中國大部分地區流行，各地也均出現了關于CVA10感染發病的報道。2008～2009年，在對山東省760例手足口病患兒的臨床標本進行病毒分離和基因測序的過程中，共分離出330株病毒，其中10株為CVA10，分離率1.32%，基因進化分析表明CVA10存在著兩個共同循環的基因型[15]。在對河南省、山東省、重慶市2009～2011年間發生的手足口病研究中發現，CVA10的流行季節為每年的4～8月份，并在5月份達到高峰(51.2%)，且多數患兒的年齡為25個月[16]。2010～2012年，廣州市收集到的樣本中，檢測到CVA10在8月份感染率達到高峰(4.3%)，年齡構成在0歲組的感染率最高(3.7%)[17]。濟南市由CVA10引起手足口病的發生率分別為20.99%、11.69%和38.18%，感染季節為春季和夏季，秋季和初冬出現輕微高峰。感染年齡在1～2歲兒童中最常見(64.38%)，2歲時為高峰(42.47%)，且男女性別比例為1.52∶1[18]。石家莊市分別在2010年和2012年暴發了兩次由CVA10導致的手足口病，且2010年感染CVA10的流行率較高，5、6月份兩個月出現感染高峰，占實驗室確診病例的4.7%。重要的是，在重癥當中，CVA10感染占4.8%，是繼EV71血清型之后第2個引起嚴重手足口病的病原體[19]。2011～2012年在對阜陽地區手足口病臨床實驗檢測過程中，CVA10的檢出率為18.8%[20]。2012～2013年，上海市通過對手足口病患者的腸道病毒類型進行分析，發現感染CVA10占到7.5%，患兒男性∶女性為1.77∶1，年齡在0～3歲之間[21]。武漢市在此期間暴發手足口病，經鑒定，CVA10是流行率最高的病原體(52.8%)，并在2013年4月取代EV71和CVA16，成為最主要的手足口病相關病原體[22]。2011～2014年，CVA10病例在福建省手足口病病原譜的年度構成比分別為11.0%、6.0%、18.4%和9.2%[23]。2015年貴陽市共收集到607份診斷為手足口病的標本，其中檢測到CVA10陽性病例71例(11.7%)，患兒的年齡多在3歲以下，以1～2歲為主，占病原體型別總數的30.99%(22/71)，同時發現CVA6+CVA10混合感染1例[24]。另外，廈門市CVA10感染率占手足口病病例的6.8%，占嚴重手足口病病例的38.9%。基于VP1基因序列的系統發育分析表明，CVA10感染與嚴重手足口病病例的增加可能與廈門當前流行毒株(進化枝E)中一個新譜系(譜系A)的出現有關，該菌株的結構蛋白和非結構蛋白中存在有5′UTR，它的4個核苷酸發生改變，5個氨基酸被取代。2016年，湖北省部分地區的CVA10陽性檢出率為22.9%[25]。統計分析表明，2009、2010和2012年這3年，深圳市CVA10感染患者的平均年齡低于感染EV71的患者的平均年齡，這說明CVA10感染人群可能逐漸幼齡化[26]。

雖然國內有報道的CVA10感染流行時間晚于國外，但流行率逐年上升，流行范圍逐漸擴大，人們的關注程度也越來越高。在手足口病暴發期間，除發現CVA10感染外，還檢測出CVA6、EV71和(或)CVA16的混合感染，這在很大程度上增加了手足口病的感染強度和病毒基因重組的概率。

3.CVA10致手足口病的基因分型概況：目前，國際上并沒有統一的CVA10基因分型標準，通常根據VP1或VP4基因的差異性來對毒株進行分類。

有報道稱，中國大陸地區CVA10流行毒株的基因型以C型為主，從GenBank核苷酸序列數據庫中檢索出2004～2016年間具有完整VP1基因核苷酸序列(894bp)的分離株273株，包括北京市、深圳市、石家莊市、山東省、長沙市、云南省、安陽市等中國大陸地區流行株218株；以及法國和美國等國外流行株55株[27]。通過一定方法對VP1基因核苷酸序列進行分析，構建系統進化樹，將CVA10毒株劃分為4個基因型(A～D型),其中B型和C型毒株均為中國大陸分離株，且有210株屬于C型分離株。還有研究者根據VP1基因的差異性≥15%，將CVA10毒株劃分為7個基因型(A～G型)[28]。2008～2012年間，深圳市60株CVA10菌株，除2株屬于基因型F(2009年被分離)外，其余均屬于基因型C[17]。2009～2012年間,石家莊市分離株有少數屬于基因型B，其余均為基因型C。

有研究者運用最大似然法在VP4全基因(207bp)的基礎上構建系統發育樹，從武漢市2012～2013年的臨床標本中分離出190株CVA10菌株，對其VP4基因進行測序[22]。結果表明，其中187株CVA10菌株的核苷酸序列相同，另外3株CVA10菌株屬于另一個核苷酸序列，但它們全部屬于系統發育樹中的中國菌株的進化枝。

CVA10基因分型需要一個統一的標準，這樣不僅有利于流行病學的研究，同時對CVA10致手足口病疫苗的研發也至關重要。

二、CVA10致手足口病的預防性疫苗

CVA10疫苗的研發主要集中在滅活疫苗以及病毒樣顆粒疫苗等方面，目前均處于實驗室研究階段。

1.滅活疫苗：甲醛滅活或β-丙內酯滅活的CVA10全病毒疫苗，可以在成年小鼠中誘導免疫應答，在母體中獲得的中和抗體能夠傳遞給新生小鼠，提供免疫保護[4]。最近有研究發現，甲醛滅活的全病毒CVA6和CVA10 2價疫苗，通過皮下注射可以誘導抗原特異性全身免疫應答，不僅可以保護主動免疫或被動免疫的小鼠，還可以在母體中誘導高水平的中和抗體，并傳遞給新生小鼠。結果表明這兩種抗原之間在誘導病毒特異性免疫反應方面沒有免疫干擾[29]。研究發現，用甲醛滅活的EV71、CVA6、CVA10和CVA16多價疫苗候選物的組合在小鼠和兔子免疫原性研究中均引發中和抗體應答。用這種四價HFMD候選疫苗免疫的小鼠和兔子雖然觀察到有相互輕微的抗原干擾，但都產生了EV71、CVA6、CVA10和CVA16的抗血清[30]。這表明了利用甲醛滅活多價疫苗的可行性，但需要進一步研究確定多價HFMD疫苗中各種抗原成分的最佳比例。有研究者通過比較在不同條件下，將甲醛或β-丙內酯(BPL)對CVA10、CVA6和CVA16這3種病毒進行滅活，發現CVA6用這兩種方法滅活后，可以誘導相似的免疫應答；而CVA10和CVA16的免疫功效則是BPL滅活比甲醛滅活效果更好。研究發現，用BPL-滅活(BPL-inactivation，BI)的單價疫苗接種的小鼠，對異源菌株沒有足夠的交叉反應性或交叉保護性；而用BI-3價接種的小鼠，誘導了足夠的中和抗體和細胞介導的免疫應答，表明了BI-CVA6、CVA10和CVA16是潛在的多價疫苗候選物[30]。

2.病毒樣顆粒疫苗：與滅活的全病毒疫苗方法比較，病毒樣顆粒(VLP)缺乏病毒核酸、復制和感染性，與其同源病毒的衣殼體相似，在形態上類似于真正的病毒, 具有天然病毒的類似嗜性，可以在重組表達系統中產生，能被細胞攝取并在細胞內運輸，激發全面免疫反應,用作疫苗非常安全。有研究曾分別在巴斯德畢赤酵母中產生了EV71、CVA16和CVA6的重組病毒樣顆粒(VLP)，并在臨床前研究中證明了它們能夠誘導針對小鼠被同源病毒攻擊的保護性免疫[29]。同樣，CVA10的重組病毒樣顆粒(VLP)也可以有效地誘導小鼠中的抗原特異性血清抗體，且抗VLP血清能夠有效地中和同源和異源性CVA10菌株，保護新生小鼠免于致死性CVA10感染。有研究發現，使用桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統分別產生EV71-VLP、CVA16-VLP、CVA6-VLP和CVA10-VLP，然后將這4種病毒樣顆粒(VLP)組合以配制4價VLP疫苗，并將4價VLP疫苗的免疫原性和保護效力與單價VLP疫苗進行比較。小鼠免疫研究表明，四價疫苗可引發持久的血清抗體反應，且被動免疫的小鼠能夠針對EV71、CVA16、CVA10和CVA6病毒的單一或混合感染產生有效的保護。這為未來開發手足口病多價疫苗提供了重要的信息和參考。

三、展 望

腸道病毒的感染嚴重影響兒童的健康。我國2008年后手足口病的持續高流行態勢以及2011年后手足口病病原譜的改變，造成手足口病的病毒類型在逐漸發生著變化，對防控嚴重手足口病提出了新的挑戰。手足口病的發生由多種病原體導致，理想的疫苗應能對多種病原體感染產生長時間的保護。目前，正式投入市場的EV71型滅活疫苗，接種后可刺激機體產生抗EV71的免疫力，用于預防EV71感染所致的手足口病。但它不能預防其他腸道病毒(包括CVA16、CVA6、CVA10等病毒)感染所致的手足口病。所以，進一步研發單獨的CVA10疫苗，或研發EV71、CVA16、CVA6和CVA10多價疫苗，或研究不同病原體之間的共性，對研發廣譜高效疫苗具有重要意義。