組織蛋白酶S對HIV相關神經認知功能障礙的調控作用及其機制研究

羅 漣 師金川 顏廷波 倪霜玲 周佳君

獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)是世界上首要的公共衛生問題，截止2015年底，全球已有AIDS患者近400萬，其中我國50余萬人[1]。在我國，HIV感染者中HIV相關神經認知功能障礙(HIV-associated neurocognitive disorders，HAND)已達40%。HAND已成為HIV感染者死亡的重要原因，尋找早期識別、診斷、治療HAND的方法成為當下迫切需要解決的問題。有研究顯示，HIV患者半胱氨酸組織蛋白酶S(cathepsin S，CTSS)水平升高，并與腦脊液中HIV-1載量呈正相關[2]。而其內源性抑制劑胱抑素C(cystatin C，Cys C)在HAND患者中水平下降[3]。有研究者認為，CTSS可能通過促進gp120與CD4結合，進而加速病毒與宿主細胞的膜融合，從而導致HAND的發生與進展[4,5]。本研究擬通過對HAND患者與non-HAND患者腦脊液和血漿進行檢測，分析其CTSS、Cys C表達水平和HIV RNA、gp120蛋白水平，從而明確HAND患者CTSS、Cys C表達水平的特征性改變及與HIV病毒載量、HIV表面蛋白gp120的關系，分析CTSS、Cys C水平與疾病發生的相關性，為HAND預防和治療提供新的思路及理論依據。

資料與方法

1.一般資料:選擇自2015年6月～2017年6月期間在筆者醫院治療的30例HAND患者作為研究對象，HAND的診斷標準：聯合運用國際HIV癡呆量表(IHDS)、Hopkins言語學習測試、利手和非利手Grooved Pegboard實驗(Grooved Pegboard dominant and non-dominant Hands)、接龍試驗A和B(trail making test: parts A and B)、中國修訂韋氏成人智力量表(Wechsler Adult Intelligence Scale-Revised by China, WAIS-RC)進行診斷[6,7]。其中，男性21例，女性9例，患者年齡18～50歲，平均年齡35.75±9.43歲。選擇30例HIV非神經認知功能障礙患者(non-HAND)作為對照，其中，男性20例，女性10例，患者年齡18～48歲，平均年齡36.04±8.97歲。HAND組和non-HAND組患者年齡、性別等一般資料之間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。納入標準：①年齡18～50歲，男女性別不限；②市疾控中心檢測確診HIV陽性的AIDS患者；③小學及以上文化程度；④意識清楚，能配合完成量表檢查；⑤既往無精神疾病史，無精神病陽性家族史；⑥患者或其法定監護人自愿參加并簽署知情同意書。排除標準：①活動性心理障礙；②活動性或既往中樞神經系統機會性感染；③乙醇中毒；④既往吸食過鴉片、大麻、可卡因、海洛因等毒品或毒品成癮者；⑤肢體殘疾(如截肢)、嚴重機能障礙或嚴重內科疾病而影響神經心理測試。本研究獲得了筆者醫院醫學倫理學委員會的批準，所有受試者均簽署了知情同意書。

2.腦脊液和血漿中CTSS mRNA、Cys C mRNA和HIV RNA水平檢測：以無菌方法取所有入組患者腦脊液3～5ml，凍存于-80℃冰箱中待測。采集EDTA抗凝靜脈血即刻1800r/min 離心分離血漿，凍存于-80℃冰箱中待測。從-80℃冰箱中取出腦脊液和血漿樣品，分成2份，其中1份用于檢測CTSS mRNA、Cys C mRNA和HIV RNA水平，使用RNA提取試劑盒(貨號：4449079，批號：2015020301，美國Thermo Fisher Scientific公司)提取CTSS mRNA、Cys C mRNA，HIV RNA，然后使用反轉錄酶試劑盒(貨號：K1622，美國Fermentas公司)合成cDNA，通過反轉錄PCR(RT-PCR)試劑盒(貨號：10928042，批號：201501057，美國Thermo Fisher Scientific公司)檢測CTSS mRNA、Cys C mRNA和HIV RNA水平，以GAPDH mRNA作內參，采用2-ΔΔCt法分析mRNA或RNA的相對表達水平。另一份腦脊液和血漿樣品用于檢測CTSS、Cys C、gp120蛋白水平。

3.腦脊液和血漿中CTSS、Cys C、gp120蛋白水平：取另一份腦脊液和血漿樣品，使用酶聯免疫吸附法試劑盒檢測腦脊液和血漿中CTSS、Cys C、gp120蛋白水平，CTSS、Cys C蛋白ELISA檢測試劑盒購于英國Abcam公司，貨號分別為ab155427、ab119589，批號分別為A201801042、A201802041。gp120蛋白ELISA檢測試劑盒購于南京森貝伽生物科技有限公司，貨號為SBJ-H1622，批號為20180304251。所有試劑盒檢測操作方法均嚴格按照試劑盒說明書進行，每個樣本檢測3個復孔。

結 果

1.腦脊液中CTSS、Cys C、HIV RNA、gp120水平:HAND組患者腦脊液中CTSS mRNA、CTSS蛋白、HIV RNA和gp120蛋白水平均顯著高于non-HAND組，而Cys C mRNA和Cys C蛋白水平顯著低于non-HAND組，差異有統計學意義(P=0.000)，詳見表1。

表1 HAND組和non-HAND組腦脊液中CTSS、Cys C、HIV RNA、gp120水平比較

2.血漿中CTSS、Cys C、HIV RNA、gp120水平:HAND組患者血漿中CTSS mRNA、CTSS蛋白、HIV RNA和gp120蛋白水平均顯著高于non-HAND組，而Cys C mRNA和Cys C蛋白水平顯著低于non-HAND組，差異均有統計學意義(P=0.000)，詳見表2。

表2 HAND組和non-HAND組血漿中CTSS、Cys C、HIV RNA、gp120水平比較

3.CTSS表達水平與HIV RNA相關性:腦脊液(CSF)中CTSS mRNA水平與HIV RNA水平(r=0.61)、CTSS蛋白水平與HIV RNA水平(r=0.60)以及血漿中CTSS mRNA水平與HIV RNA水平(r=0.53)、CTSS蛋白水平與HIV RNA水平(r=0.60)均呈正相關，詳見圖1。

圖1 CTSS表達水平與HIV RNA水平相關性

4.CTSS表達水平與gp120相關性:腦脊液(CSF)中CTSS mRNA水平與gp120蛋白水平(r=0.79)、CTSS蛋白水平與gp120蛋白水平(r=0.64)以及血漿中CTSS mRNA水平與gp120蛋白水平(r=0.64)、CTSS蛋白水平與gp120蛋白水平(r=0.59)均呈正相關，詳見圖2。

5.Cys C表達水平與HIV RNA相關性:腦脊液(CSF)中Cys C mRNA水平與HIV RNA水平(r=-0.71)、Cys C蛋白水平與HIV RNA水平(r=-0.50)以及血漿中Cys C mRNA水平與HIV RNA水平(r=-0.52)、Cys C蛋白水平與HIV RNA水平(r=-0.43)均呈負相關，詳見圖3。

6.Cys C表達水平與gp120蛋白相關性:腦脊液(CSF)中Cys C mRNA水平與gp120蛋白水平(r=-0.76)、Cys C蛋白水平與gp120蛋白水平(r=-0.36)以及血漿中Cys C mRNA水平與gp120蛋白水平(r=-0.44)、Cys C蛋白水平與gp120蛋白水平(r=-0.57)均呈負相關，詳見圖4。

圖2 CTSS表達水平與gp120蛋白水平相關性

圖3 Cys C表達水平與HIV RNA水平相關性

圖4 Cys C表達水平與gp120蛋白水平相關性

討 論

HIV病毒除了破壞免疫系統，它還引發神經認知疾病[8,9]。高效抗反轉錄病毒治療(highly active anti-retroviral therapy，HAART)是目前臨床上治療艾滋病最有效的方法，降低了發生率和病死率，但HAND發生率并未改善。2016年，Fields等[10]研究顯示，HAND的發生率可達到50%左右。HAND的早期診斷和治療顯然已經迫在眉睫。

目前，關于HIV感染中樞神經系統的發病機制尚未明確，其研究集中于HIV直接或間接對神經系統的損傷以及宿主發生免疫應答導致的神經毒性作用[11,12]。受HIV-1感染的單核-吞噬細胞、膠質細胞可釋放病毒蛋白如Tat、Vpr、Nef，以及囊膜糖蛋白Env的表面蛋白gp120和跨膜蛋白gp41等，均可參與直接的中樞神經毒性反應[13]。而HAND的間接發病機制與小膠質細胞、腦巨噬細胞和中樞神經系統中炎性細胞因子造成的炎性反應及腦屏障的通透性改變有關[14]。以上兩種致病機制最終均是通過神經細胞的凋亡而引起HAND。

半胱氨酸組織蛋白酶S(cathepin S，CTSS)是半胱氨酸組織蛋白酶家族中的成員，具有降解細胞內及細胞外基質的功能，調控血管內皮細胞的完整性[15]。有研究發現CTSS抑制劑對腦外傷小鼠具有一定的神經保護作用，提示CTSS可能是治療神經系統損傷的一個潛在分子靶標[16]。CTSS表達水平與內源性抑制劑胱抑素C(cystatin C，Cys C)呈正相關，CTSS/Cys C比例平衡維持其生理功能[17]。通過蛋白質組學研究發現，cystatin C在HAND患者CSF中水平下降[18]。而細胞實驗顯示cystatin C具有抗HIV作用，進一步提示CTSS在HAND的發病過程中起到重要作用[19]。

本研究結果發現，在HAND患者的腦脊液和血漿中CTSS表達水平顯著高于non-HAND患者，同時HIV病毒載量和gp120蛋白表達水平也顯著高于non-HAND患者，而筆者檢測Cys C蛋白表達水平結果發現，HAND患者腦脊液和血漿中CysC蛋白表達水平均顯著降低，與Laspiur等[18]研究結果一致。由此結果可以看出，HAND患者腦脊液和血漿中CTSS表達水平與HIV病毒載量以及gp120蛋白水平均呈正相關，而Cys C表達水平與HIV病毒載量和gp120蛋白表達水平均呈負相關。gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并與gp41通過非共價作用結合。在病毒入侵過程里，gp120結合細胞表面受體CD4和復合受體CCR5或CXCR4，觸發Env巨大的構象變化，然后gp41膜融合蛋白又通過一連串的大范圍的蛋白質重折疊，最終導致病毒與宿主細胞的膜融合[20]。筆者分析認為CTSS表達對抗原遞呈和組織重構中的胞內和胞外蛋白轉換相關，CTSS可能通過促進gp120與CD4結合，進而加速病毒與宿主細胞的膜融合，從而導致HAND的發生與進展。而以CTSS為靶標，通過干預CTSS表達水平，以糾正CTSS/Cys C這一失衡狀態為切入點可能為HAND治療提供新的思路。

本研究存在以下不足之處，首先由于技術手段限制未能檢測CD4+、CD8+、CD3+淋巴細胞水平,其次沒有檢測隨訪結果，因此未能就HAND緊張情況做進一步研究；最后，由于樣本量較小，相關研究結果需要進一步擴大樣本量進行研究。綜上所述，HAND患者體內CTSS水平較高，Cys C水平較低，CTSS可能促進HIV與宿主細胞膜的融合從而促進HAND的發展，但還需要進一步研究證實。