慢病毒介導miR-215過表達對克羅恩病的影響及作用機制

克羅恩病(CD)以非特異性的炎性損傷、肉芽腫、結腸局灶性為主要病變特征[1]。CD患者通常有腹痛、腹瀉、便血等癥狀，嚴重影響患者的生活質量[2]。有研究發現，miR-215的上調與自噬等信號通路相關[3]。自噬參與了CD的炎性反應和組織損傷，抑制自噬有助于緩解CD癥狀[4-5]。因此推測，miR-215可能通過調節自噬對CD起到緩解作用。本研究通過2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)誘導建立小鼠CD模型，探究miR-215在CD中的作用及對自噬的調控作用。

1 材料

1.1 實驗動物

48只BALB/c小鼠，SPF級，體質量為(20±2)g，6～8周齡，由北京軍事科學院實驗動物中心提供。實驗小鼠置于溫度為(21±2)℃、濕度為(55±10)%、12 h/12 h明暗周期的環境中，保證每只實驗小鼠可以自由地接觸水源和食物。

1.2 試劑與儀器

試劑：TNSB(美國Sigma公司)，白細胞介素-8(IL-8)、IL-10、ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)，基因組DNA提取試劑盒(日本TaKaRa公司)，AMV逆轉錄酶試劑盒(日本TaKaRa公司)，SYBR Green(美國Amibion公司)，Lenti-miR-215(上海吉瑪公司)，HE染色試劑盒(武漢博士德公司)，Beclin1多克隆抗體、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)多克隆抗體、IL-1β多克隆抗體(美國Santa Cruz生物技術公司)，髓過氧化物酶(MPO)檢測試劑盒(南京建成科技有限公司)。

儀器：酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，PCR儀(美國Bio-Rad公司)，水平電泳槽(北京六一儀器廠)，電泳儀(北京六一儀器廠)，低溫高速離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

2 方法

2.1 造模與分組

選取48只小鼠，予以禁食不禁水12 h，乙醚麻醉，隨機分成兩組，空白組(A組)和模型組，A組12只灌腸給予50%的乙醇溶液100 μL，模型組36只肛門注入濃度為2.5%的TNBS乙醇溶液100 μL，注射完畢后倒提小鼠30 s防止液體流出。造模后每日觀察小鼠的體質量、排便情況、進食情況以及精神狀態[6]。3 d后，空白組隨機選取2只，模型組隨機選取6只處死，取結腸組織進行病理學觀察，判斷TNBS誘導的小鼠CD模型構建成功與否。將造模成功的30只小鼠隨機分成3組，設為TNBS組(B組)、Lenti-Scramble(C組)和Lenti-miR-215(D組)，每組各10只。A組灌腸給予100 μL生理鹽水，B組灌腸給予100 μL生理鹽水，C組灌腸給予100 μL慢病毒載體，D組灌腸給予100 μL表達miR-215的慢病毒載體。連續灌腸2周，每周2次。

2.2 小鼠疾病活動度的評價方法

小鼠疾病活動指數(DAI)評估：每日觀察小鼠的體質量和糞便，行糞便潛血實驗。根據表1進行DAI評分。DAI=(體質量下降分數+糞便性狀分數+便血分數)/3，體質量減失率(%)=(實驗前體質量-造模后體質量)/實驗前體質量×100%[7]。

表1 小鼠DAI評分

2.3 ELISA法檢測血清IL-8、IL-10、MPO的水平

入組小鼠麻醉后下腔靜脈取血，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，取上層血清。采用ELISA法檢測血清中IL-8和IL-10、MPO水平，實驗操作過程嚴格按照說明書進行。

2.4 HE染色檢測結腸組織病理改變

將在多聚甲醛中固定過的結腸組織制作成4 μm厚的石蠟切片，進行HE染色，觀察結腸組織病理學改變。

2.5 Real-time PCR檢測結腸組織內miR-215 mRNA和Beclin1 mRNA的表達

用Trizol試劑提取結腸組織內的總RNA，逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模版進行PCR擴增，各基因的引物序列見表2，反應體系10 μL，反應條件為95 ℃ 預變性10 min，隨后95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，循環40次。采用2-ΔΔCt法計算結果。

表2 引物序列

2.6 Western blotting檢測結腸組織內Beclin1蛋白、TNF-α和IL-1β蛋白的表達

使用含PMSF的RIPA裂解液制備蛋白樣品，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，上樣。60 V電泳30 min，80 V電泳90 min，橫流200 mA轉膜100 min。轉膜完畢后5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗(1∶1 000)4 ℃過夜，PBST洗3次，每次10 min，二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h，然后再用PBST洗3遍，然后加入ECL發光液進行曝光顯影。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 各組小鼠DAI評分比較

A組、B組、C組、D組DAI評分分別為0.25±0.12、3.52±0.55、3.34±0.67、1.55±0.32，四組間相比較，差異具有統計學意義(F=185.30，P<0.001)。B組、C組、D組DAI評分高于A組，差異具有統計學意義(P<0.05)。與B組相比，C組DAI評分沒有顯著性差異(P>0.05)，D組DAI評分顯著降低(P<0.05)。與C組相比，D組DAI評分顯著降低(P<0.05)。

3.2 各組小鼠結腸組織學觀察

由圖1可知，A組結腸黏膜結構完整，分層清晰，上皮細胞排列緊密，杯狀細胞連續分布，腺管結構完整，固有層沒有炎性細胞浸潤。B組結腸組織上皮細胞數量減少，腺體缺失，黏膜層破壞嚴重，炎性細胞大量浸潤黏膜固有層。C組結腸組織表現出與B組類似的炎性癥狀。D組結腸組織切片與A組類似，結腸組織細胞排列緊密，結構完整，層次清晰。

圖1各組小鼠結腸組織學觀察 HE ×200A空白組的結腸組織BTNBS組的結腸組織CLenti-Scramble組的結腸組織DLenti-miR-215組的結腸組織

3.3 各組小鼠結腸組織IL-8、IL-10和MPO水平比較

A組、B組、C組、D組結腸組織IL-8、IL-10和MPO水平比較，差異均具有統計學意義(F=25.64、7.25、21.14，P<0.001)。與A組相比，B組、C組結腸組織IL-8、MPO水平均升高而IL-10水平降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。與B組相比，C組結腸組織IL-8、MPO、IL-10水平的差異無統計學意義(P>0.05)，D組結腸組織IL-8、MPO水平均顯著降低，IL-10水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與C組相比，D組結腸組織IL-8、MPO水平顯著降低而IL-10水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

3.4 各組小鼠結腸組織miR-215 mRNA和Beclin1 mRNA表達水平的比較

A組、B組、C組、D組結腸組織miR-215和Beclin1 mRNA表達水平比較，差異均具有統計學意義(F=39.73、7.25、21.14，P<0.001)。與A組相比，B組、C組、D組結腸組織miR-215 mRNA表達水平降低，B組、C組Beclin1 mRNA表達水平降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。與B組相比，C組結腸組織miR-215、Beclin1 mRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，D組結腸組織miR-215、Beclin1 mRNA表達水平均顯著升高(P<0.05)。與C組相比，D組結腸組織miR-215、Beclin1 mRNA表達水平均顯著升高(P<0.05)。見表4。

表3 各組小鼠結腸組織IL-8、IL-10和MPO水平的比較()

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05

表4 各組小鼠結腸組織miR-215 mRNA和Beclin1 mRNA表達水平的比較()

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05

3.5 各組小鼠結腸組織Beclin1蛋白、TNF-α蛋白和IL-1β蛋白表達水平的比較

A組、B組、C組、D組結腸組織Beclin1蛋白、TNF-α蛋白和IL-1β蛋白表達水平比較，差異均具有統計學意義(F=11.36、26.73、21.14，P<0.001)。與A組相比，B組、C組結腸組織Beclin1蛋白表達水平降低，TNF-α、IL-1β蛋白表達水平均升高，D組TNF-α、IL-1β蛋白表達水平升高，差異均有統計學意義(P均>0.05)。與B組相比，C組結腸組織Beclin1、TNF-α、IL-1β蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，D組結腸組織Beclin1蛋白表達水平顯著升高，同時TNF-α、IL-1β蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。與C組相比，D組結腸組織Beclin1蛋白表達水平顯著升高，TNF-α、IL-1β蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見表5、圖2。

圖2 各組小鼠結腸組織Beclin1蛋白、 TNF-α蛋白和IL-1β蛋白的表達表5 各組小鼠結腸組織Beclin1、TNF-α和 IL-1β蛋白表達水平的比較()

組別例數Beclin1TNF-αIL-1βA組100.42±0.120.16±0.140.16±0.07B組100.20±0.09a0.69±0.13a0.71±0.16aC組100.17±0.05a0.75±0.15a0.76±0.23aD組100.33±0.06bc0.40±0.09abc0.41±0.17abc

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05

4 討論

炎癥性腸病(IBD)包括潰瘍性結腸炎(UC)和CD兩種類型。CD是一種慢性的胃腸道肉芽腫炎性反應，其發病率在發達國家較高，在中國則呈逐年升高趨勢[8-9]。有研究表明，miR-215可能是預測CD的生物學標志物[10]，但是miR-215在CD中的作用機制仍待探究。

為了研究miR-215對CD的影響，本實驗首先采用TNBS建立小鼠CD模型。小鼠DAI評分結果顯示，與A組相比，B組小鼠DAI評分顯著升高，結腸組織HE染色顯示上皮細胞數量減少，腺體缺失，黏膜層破壞嚴重，炎性細胞大量浸潤黏膜固有層，促炎因子IL-1β、IL-8和TNF-α水平顯著升高，而抗炎因子IL-10水平顯著降低，表明CD模型構建成功。通過比較正常小鼠和CD小鼠結腸組織中miR-215的水平，發現CD小鼠中miR-215的表達水平顯著降低，表明miR-215可能參與CD的發展。為了進一步研究miR-215對CD的影響，本實驗通過灌腸給予CD小鼠表達miR-215的腺病毒載體后，發現miR-215的高表達可以顯著降低小鼠的DAI評分，并且顯著改善結腸組織的病理學改變，同時會使促炎因子IL-1β、IL-8和TNF-α水平顯著降低，抗炎因子IL-10水平顯著升高，表明miR-215確實與CD存在密切的聯系。

Beclin1也稱Atg6，是哺乳動物中首個被發現的可以調節自噬的基因，是啟動自噬發生的一個重要開關[11]。有研究發現，Atg16L1基因敲除會導致腸道炎性反應和腸道上皮細胞發生損傷，自噬基因Atg2A突變也可能與CD的發生有關[12-15]。本研究發現miR-215過表達可以使小鼠結腸組織Beclin1的mRNA和蛋白的表達水平顯著升高，表明過表達miR-215可能是通過Beclin1介導的自噬通路發揮改善CD的作用的。Paul等[16]發現，自噬可以減少IL-1β等促炎因子的釋放。本研究結果發現，miR-215過表達可以使CD小鼠Beclin1 mRNA及其蛋白水平升高，增加結腸組織自噬的同時，降低促炎因子IL-1β、IL-8和TNF-α的表達水平，并升高抗炎因子IL-10的表達水平，表明自噬水平的升高可以減少相關促炎因子的釋放，升高抗炎因子的水平，從而減輕CD過程中的炎性損傷程度。

綜上所述，miR-215的過表達對于TNBS誘導的CD具有保護作用，而且該作用與Beclin1介導的自噬通路有關。