RNA干擾Twist基因表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116增殖和凋亡的影響

錢江 朱春麗 楊欽文 陳鵬 傅仲學(xué)

(1.重慶市墊江縣中醫(yī)院普外科，重慶 408300；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，重慶 400010)

結(jié)直腸癌(CRC)是國內(nèi)第三常見的惡性腫瘤疾病，也是世界第四常見的死亡原因[1-2]。盡管在早期診斷率、綜合治療的有效性、手術(shù)切除率以及術(shù)后存活率方面都有所提高，但根治CRC的方法仍然有限，結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移削弱了治療效果，導(dǎo)致高死亡率。轉(zhuǎn)移與細(xì)胞逐漸失去上皮表型并獲得間充質(zhì)表型的生物轉(zhuǎn)化過程密切相關(guān)，稱為上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)[3]。EMT的特征是上皮表面標(biāo)志物，特別是E-鈣粘蛋白(E-cadherin)的丟失。在乳腺癌、前列腺癌、肝癌和肺癌中EMT是腫瘤進(jìn)展的重要步驟之一，是腫瘤細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)的必要條件。我們前期研究也證明了Twist和E-cadherin蛋白的表達(dá)可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，Twist和E-cadherin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系提示，在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中可能是通過抑制E-cadherin蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的[4]。E-cadherin在胚胎發(fā)育和形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞增殖、存活、侵襲和遷移中起重要作用。本文通過Twist基因shRNA慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞，觀察其在體外對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為結(jié)直腸癌基因靶向治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料和試劑 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116由中科院上海細(xì)胞研究所提供，pTracer-CMV/BSD-Twist和pTracer-CMV/BSD質(zhì)粒來源于重慶醫(yī)科大學(xué)生科院實(shí)驗(yàn)室。上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)構(gòu)建了pGenesil-Twist-shRNA、pGenesil-GFP Vector和pGenesil-shRNA三種質(zhì)粒。成功構(gòu)建質(zhì)粒，經(jīng)DH5α轉(zhuǎn)化，從大腸桿菌中提取純化。DNA的雙限制酶消化使用酶NheI、BsaI、SacI和EcorI，并且我們進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以確認(rèn)和分離消化的DNA。所有序列均經(jīng)上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司確認(rèn)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 用含二甲基亞砜(DMSO)低溫保護(hù)劑來儲(chǔ)存低溫保存的培養(yǎng)細(xì)胞，參照說明書，使用脂質(zhì)體Lipo2000試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分組為：空白對(duì)照(control)組，陰性siRNA(negative siRNA)組和TwistsiRNA轉(zhuǎn)染組。

1.2.2Real-time PCR檢測(cè)Twist、E-cadherin基因mRNA的表達(dá) 用三唑試劑(Invitrogen)從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中提取總RNA，采用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)進(jìn)行cDNA合成，定量實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)Twist和E-cadherin的相對(duì)表達(dá)水平。測(cè)定三個(gè)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)，并標(biāo)準(zhǔn)化為參考基因GAPDH的表達(dá)。引物用于PCR擴(kuò)增的引物有：Twist上游引物： 5’-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3’;下游引物：5’-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3’; E-cadherin上游引物：5’-GTGTCATCCAACGGGAATGC-3’，下游引物：5’-TGGCGGCATTGTAGGTGTTC-3’。用熒光定量實(shí)時(shí)PCR儀和SYBR選擇母體混合液進(jìn)行40個(gè)周期的qPCR擴(kuò)增，包括三個(gè)步驟：變性溫度為1 min，引物退火溫度為54 ℃為45 s，延伸溫度為72 ℃為2 min。用ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)含量。

1.2.3Western blot法檢測(cè)HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞中Twist、E-cadherin的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞在冰上在裂解緩沖液中裂解30 min。將細(xì)胞提取的等量蛋白質(zhì)應(yīng)用于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。在4 ℃下，將抗Twist、抗E-cadherin和抗GAPDH(1∶1 000稀釋)一起孵育過夜。膜是用辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)多克隆抗體(1∶1 000)在室溫下洗滌和孵育2 h。用Bradford蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定印跡蛋白。

1.2.4MTT法測(cè)定HCT116細(xì)胞增殖活性 胰酶消化對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，制備濃度為1～108cells/L單細(xì)胞懸液，96孔板每孔接種100 μL，基因沉默方法同前，MTT比色法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后1、2、3、4、5、6和7 d 細(xì)胞增殖活性和生存能力。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 細(xì)胞周期綠色熒光蛋白(GFP)編碼的DNA質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染后48 h在倒置熒光顯微鏡IX70下表達(dá)綠色熒光。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，采用胰蛋白酶化法獲得細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

2 結(jié) 果

2.1Real-time PCR檢測(cè)Twist、E-cadherin基因的表達(dá) 病毒感染HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞后，通過Real-time PCR 檢測(cè)可見轉(zhuǎn)染組Twist基因表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞中Twist基因的表達(dá)水平，有明顯的抑制作用(P<0.05)(圖1)。轉(zhuǎn)染組E-cadherin基因表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞中E-cadherin基因的表達(dá)水平(P<0.05)，見圖2。

圖1Twist基因沉默在結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞Twist mRNA表達(dá)圖2E-cadherin基因沉默在結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞E-cadherin mRNA表達(dá)

2.2Western blot檢測(cè)Twist基因在HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá) pGCSIL-GFP-shTwist慢病毒對(duì)Twist蛋白表達(dá)的變化，與空載體組對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染組Twist蛋白的表達(dá)量顯著降低(圖3)(P<0.05)。與空載體組對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染組E-cadherin蛋白的表達(dá)量顯著增高(圖4)(P<0.05)。

注：1.Blank control group；2.Negative control group；3.Twist siRNA group。

圖3Twist基因沉默在結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞Twist蛋白表達(dá)

注：1.Blank control group；2.Negative control group；3.Twist siRNA group。

圖4Twist基因沉默在結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)

2.3轉(zhuǎn)染細(xì)胞的MTT增殖試驗(yàn)結(jié)果 HCT116細(xì)胞增殖能力在轉(zhuǎn)染pGCSIL-GFP-shTwist沉默Twist基因后明顯降低，且干擾組細(xì)胞增殖生長速度較另外兩組細(xì)胞緩慢，在第4、5、6天與第7天，顯著差異(n=3，P<0.05)， 而陰性對(duì)照組與空白組間吸光度值無顯著差異(n=3，P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pGCSIL-GFP-shTwist慢病毒載體后，對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的生長具有明顯抑制作用(圖5)。

圖5 轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞Twist基因MTT增殖結(jié)果

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 HCT116細(xì)胞周期在Twist基因沉默后發(fā)生變化，Twist轉(zhuǎn)染組G0/G1期細(xì)胞百分比與陰性對(duì)照組相比，明顯增加(P<0.05)，S期細(xì)胞百分比和陰性對(duì)照組比較，有所減少，G2/M期細(xì)胞百分比低于對(duì)照組(34.2±0.6)。上述結(jié)果表明：沉默Twist基因能夠?qū)⒓?xì)胞阻滯于G0/G1期，細(xì)胞分裂明顯緩慢，見表1。

表1 三組結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞周期各期百分率比較

注：與陰性對(duì)照組比較，aP<0.05。

3 討 論

結(jié)直腸癌是世界上最常見的疾病之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[5]。盡管在病因和病理生理學(xué)存在著差異，但兩者都對(duì)該病生物學(xué)過程起至關(guān)重要的作用。其中之一就是上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)，它在人體發(fā)育過程中起重要作用，參與結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展，在組織纖維化過程中起重要作用[6]。參與EMT的細(xì)胞表現(xiàn)出許多形態(tài)和特征改變，如：細(xì)胞粘附力喪失、E-鈣粘蛋白的抑制和細(xì)胞活力增加[7]。同時(shí)，酪氨酸激酶的激活或升高，N-鈣粘蛋白、波形蛋白、纖維連接蛋白、鋅指結(jié)構(gòu)域蛋白和堿性螺旋環(huán)結(jié)構(gòu)域蛋白的上調(diào)，同時(shí)Twist基因表達(dá)與間充質(zhì)樣表型有關(guān)[8]。在基礎(chǔ)研究中，這些基因常被作為EMT的標(biāo)志物，表明細(xì)胞具有很強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)性和侵襲性。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明，EMT在原發(fā)性浸潤性乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肝癌和胰腺癌等惡性腫瘤和繼發(fā)性轉(zhuǎn)移中起重要作用。關(guān)于Twist基因在誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)中的作用以及在結(jié)腸疾病發(fā)病機(jī)制中的作用的數(shù)據(jù)在科學(xué)文獻(xiàn)中卻很少。因此，本研究選擇了與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的Twist基因。

本實(shí)驗(yàn)在結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞應(yīng)用RNA沉默技術(shù)，下調(diào)Twist基因的表達(dá)，shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染后，結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中TwistmRNA和蛋白表達(dá)量明顯減少，E-cadherinmRNA和蛋白表達(dá)量明顯增多，說明結(jié)直腸癌發(fā)生與EMT有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)表明，干擾Twist基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)后可明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。Twist基因沉默后，HCT116細(xì)胞在G0/G1期出現(xiàn)阻滯，提示沉默Twist基因后可以抑制細(xì)胞分裂，Twist基因可能是引起細(xì)胞周期改變，從而在結(jié)直腸癌的惡性增殖中發(fā)揮十分重要的作用。

總之，從目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，Twist基因的上調(diào)可促進(jìn)EMT分子事件發(fā)生，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，而Twist-shRNA能有效地抑制HCT116細(xì)胞系Twist基因的表達(dá)，升高E-cadherin基因的表達(dá)，促進(jìn)間充質(zhì)上皮的轉(zhuǎn)變，有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。Twist和E-cadherin表達(dá)在CRC的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。Twist和E-cadherin在CRC中的激活和失活可以作為預(yù)后因素和癌癥治療靶點(diǎn)，并為下一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

(本文圖3～4見封三)