血清異常糖鏈糖蛋白聯合尿細胞角蛋白-19檢測對膀胱癌早期診斷的價值

吳萬文，呂蔡，劉振湘，徐海霞，張淑芳

膀胱癌是世界第七大常見癌癥，是泌尿系統最常見的腫瘤之一［1］。男性占總發生率的80%左右［2-3］。在膀胱癌早期診斷上，膀胱鏡檢查及尿脫落細胞學檢測被公認為臨床上的金標準；但膀胱鏡檢查存在創傷大，尿脫落細胞學存在敏感性低等局限性，誤診、漏診現象明顯，致患者常錯過最佳治療時機［4］。臨床上膀胱癌的病理分期及細胞分級對于該病的診斷、治療及預后判斷很重要，但目前尚缺乏一種真正能應用于臨床的生物學標志物。異常糖鏈糖蛋白又稱腫瘤異常蛋白（TAP），是腫瘤細胞新陳代謝過程中釋放到血液中的一類異常糖基化蛋白，已被證明其與多種腫瘤的發生、發展、轉移和預后關系密切［5-6］。細胞角蛋白（CK）-19是一種水溶性酸性多肽分子，主要分布于上皮細胞中，當膀胱上皮細胞發生癌變時，CK-19便被釋放到尿液中［7］。本研究旨在探討血清TAP聯合尿CK-19檢測對膀胱癌早期診斷的應用價值，為膀胱癌早期診斷提供參考。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2015年6月—2018年9月于海口市人民醫院泌尿外科確診的膀胱癌患者（膀胱癌組）50例，男38例，女12例，平均年齡（57.84±10.39）歲；其中病理檢測結果根據WHO 2004分級系統分為乳頭狀瘤8例，低度惡性傾向的乳頭狀瘤15例，低級別膀胱癌11例和高級別膀胱癌16例。根據國際抗癌聯盟的TNM分期標準，淺表性（Tis～T1期）膀胱癌27例，浸潤性（T2～T4期）23例。納入標準：（1）均為首次經病理學手段確診為膀胱癌。（2）受試前無相關手術治療史。（3）受試前1個月內未接受放、化療及其他治療。（4）配合并自愿完成所有檢測項目。排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤、泌尿系惡性疾病、精神病等相關疾病的患者。（2）中途放棄，檢測數據不全者。選擇同期45例泌尿系良性疾病者為對照組，男32例，女13例，平均年齡（58.97±11.28）歲。納入標準：僅患尿道感染、尿路結石、慢性前列腺炎等泌尿系良性疾病，未患其他惡性腫瘤性疾病；配合并自愿完成所有檢測項目。2組性別構成（χ2=0.292）、年齡（t=0.508）差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究所有對象遵循自愿原則，均簽署知情同意書。

1.2主要試劑與儀器 血清TAP檢測試劑盒（凝集法）購自浙江瑞生醫療科技有限公司；CK-19檢測試劑盒購自武漢博士康生物工程有限公司；顯微鏡購自日本Olympus；酶標儀購自美國Bio-Tek。

1.3方法

1.3.1樣本采集 所有對象在采樣1周前均未行膀胱鏡檢、導尿、膀胱灌注等泌尿系侵入性操作。采集研究對象手指末端的2滴新鮮全血用于TAP檢測；同時采集新鮮尿液100～200 mL，新鮮尿液指無尿狀態下飲水500 mL，1～2 h后第1次膀胱排空的尿液。

1.3.2血清TAP檢測 取手指末端的2滴新鮮全血分別滴于玻片上，在玻片上推成約占玻片長度2/3的兩片均勻血片，室溫下靜置15 min待干；后取TAP檢測試劑在2片血片上各均勻滴加3滴，室溫下靜置15 min待干；后于顯微鏡下觀察凝集物的大小并測量面積，記錄所觀察的最大凝集物面積代表該樣本TAP的水平。

1.3.3尿CK-19檢測 取收集的新鮮尿液于2 h內嚴格根據說明書操作，采用酶聯免疫吸附反應檢測CK-19的水平。

1.4統計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統計學處理。符合正態分布的計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間比較用t檢驗。計數資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。偏態分布計量資料采用M（P25，P75）表示，組間多重比較采用Mann-WhitneyU檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.12組患者血清TAP及尿液CK-19水平比較 與對照組比較，膀胱癌組血清TAP及尿液CK-19水平均升高（均P＜0.01），見表1。

Tab.1 Comparison of the serum TAP and urinary CK-19 levels between the two groups表1 2組患者血清TAP及尿液CK-19水平比較

2.2二元Logistic回歸分析建立TAP與CK-19聯合診斷模型 以是否膀胱癌為因變量（是=1，否=0），TAP和CK-19為自變量，經二元Logistic回歸分析建立膀胱癌TAP與CK-19聯合診斷模型：logit［TAP聯合CK-19］=-4.118+0.030×TAP+0.327×CK-19，作為膀胱癌早期診斷新指標，見表2。

Tab.2 The results of binary Logistic analysis表2 二元Logistic回歸分析結果

2.3ROC曲線及診斷效能分析 TAP聯合CK-19檢測ROC的AUC值、約登指數均高于TAP和CK-19，提示TAP聯合CK-19診斷價值優于兩者單獨檢測，見表3、4，圖1。

Tab.3 ROC curve analysis of early diagnostic indicators of bladder cancer表3 各膀胱癌早期診斷指標ROC曲線結果分析

Tab.4 Comparison of efficacy of different methods in early diagnosis of bladder cancer表4 不同方法對膀胱癌早期診斷效能比較

Fig.1 The ROC curve of serum TAP,urine CK-19 and their combined detection圖1 血清TAP、尿CK-19及二者聯合檢測的ROC曲線

3 討論

目前，膀胱黏膜活檢以及輔助的尿脫落細胞學檢測被認為是膀胱癌診斷的金標準；然而，這些方法具有各自的局限性，因此尋找一種無創的早期診斷方法并對預后進行評估顯得十分重要。近些年，越來越多的血清和尿液中的膀胱癌標志物被發現。例如TAP、膀胱癌抗原、生存素、特異性核基質蛋白4、CK-17、CK-19等［8］。而本研究通過二元Logistic回歸分析建立TAP與CK-19聯合診斷模型，結果發現TAP聯合CK-19檢測的ROC曲線下面積及約登指數均高于TAP及CK-19單獨檢測的結果，提示兩者聯合檢測可作為膀胱癌早期診斷的新指標，并能提升單一指標檢測的診斷價值及效能。

致癌因素的刺激促進原癌基因和抗癌基因的逐漸變異，繼而導致癌癥的發生。基因突變導致了功能蛋白的變化，進而導致一大類不規則的糖鏈糖蛋白的產生［9］。其中一種是鈣-組蛋白復合物，另一種是糖鏈異常的糖蛋白，其主要分布在細胞膜上，是由變異基因翻譯后形成的功能異常的糖蛋白；與正常糖蛋白比較，其具有較長的糖鏈和復雜的分支結構，分子質量也存在很大差異［10］。TAP是異常糖蛋白、鈣組蛋白以及細胞癌變后基因表達產物的復合物，其可間接反應癌細胞的數量和癌變程度。當腫瘤細胞生長到一定數量時，TAP會釋放到外周血中，通過凝集法被檢測出。祁潔等［11］證實，血清TAP檢測乳腺癌的敏感度、特異度和準確度均高于癌胚抗原和糖鏈抗原153，可作為乳腺癌早期篩查的重要指標。吳永梅等［12］證實，TAP檢測是常見消化道腫瘤篩查、早期診斷及預后判斷的科學、有效的方法。劉麗燕等［13］證實，外周靜脈血TAP檢測非小細胞肺癌（NSCLC）敏感性較高，可用于患者的療效監測和評估。本研究顯示，50例膀胱癌患者中有35例被檢測為真陽性，仍有15例檢測為TAP陰性，筆者猜測可能存在以下幾個因素：（1）處于終末期的膀胱癌患者體內蛋白質水平較低，可導致分泌不規則的糖鏈糖蛋白的量顯著低于試劑盒的檢測范圍。（2）患者體內癌細胞增殖不活躍，進而導致不規則的糖鏈糖蛋白的分泌水平較低，而45例泌尿系良性疾病患者（對照組）有4例檢測為TAP陽性，一定程度上可能反映了這4例患者潛在的患癌風險，但仍需進一步檢測來確認。

CK-19是分子質量大約在40 ku的Ⅰ類細胞角蛋白家族成員，是在早期發育過程中最早被發現的角蛋白。此外，許多癌前組織和惡性組織均發現CK-19的表達，例如肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和結直腸癌等，提示CK-19在多種癌癥的早期診斷方面可能具有潛在優勢。CK-19陽性的肝細胞癌被證明具有早期轉移、低分化與高侵襲性等惡性生物學特性，提示其對癌癥干細胞、血管生成、腫瘤細胞侵襲性以及凋亡的作用明顯［14］。郭曉斌等［15］證實，CK-19診斷老年早期NSCLC的敏感度為85.71%，特異度為82.50%，ROC曲線下面積為0.84，優于癌胚抗原及鱗狀細胞癌相關抗原。晉學飛等［16］證實，人類軟骨糖蛋白39與CK-19在膀胱癌患者的尿液中高表達，兩者聯合檢測有利于膀胱癌的早期診斷。呂慧匯［17］證實，在膀胱癌的早期診斷中，尿CK-19檢測的敏感度顯著高于傳統尿脫落細胞學檢測，且尿端粒酶、生存素聯合CK-19檢測與單指標檢測比較能顯著提升檢測的敏感度和準確性。Huang等［18］的Meta分析結果顯示，在1 262例膀胱癌患者中，血清CK-19檢測的敏感度為42%、特異度為94%，尿液CK-19檢測的敏感度為82%、特度為80%，兩者差異顯著；但ROC曲線下面積分別為0.88和0.87，差異不明顯，提示血清和尿液CK-19均可作為膀胱癌診斷的重要指標。而本研究通過二元Logistic回歸分析建立TAP與CK-19聯合檢測的新診斷指標，結果顯示兩者聯合檢測的ROC曲線下面積、約登指數、敏感度和特異度均大于單指標檢測的結果，提示兩者聯合檢測能提升膀胱癌早期診斷的價值及效能。

綜上所述，血清TAP及尿液CK-19在膀胱癌患者中高表達；且兩者聯合檢測能提升單指標檢測的診斷價值及效能，有助于膀胱癌的早期診斷。但本研究仍存在樣本量偏少，試劑盒檢測結果不準確的局限性。因此，血清TAP聯合尿液CK-19檢測在臨床上的推廣應用仍需進一步擴大樣本去證實。