敲降胰高血糖素基因對胰島素瘤形成的影響

朱國玲，成蘭云，張恒，田浩，門秀麗△

胰島素瘤是功能性胰腺內分泌腫瘤中最常見的一種，來源于胰島β細胞［1-2］，該腫瘤具有較強的自主分泌胰島素能力，并且胰島素的分泌不受低血糖抑制，臨床上常表現為反復發作并逐漸加重的低血糖，甚至危及生命［3］。長期低血糖不僅可引起中樞神經系統的抑制癥狀，并且可誘發大量兒茶酚胺類物質釋放入血引起交感神經興奮癥狀。因其臨床表現復雜多樣，極易引起漏診、誤診和誤治［4-5］，有報道超過40%的胰島素瘤病例初診為神經系統疾病［6-7］。盡管在過去30年胰島素瘤發生率有明顯升高［8］，但目前胰島素瘤仍屬于較少見的疑難病癥，對其發病機制的了解較少，該類腫瘤的生物學特性尚有待研究。本課題組前期研究發現大鼠胰島素瘤既表達胰島素基因，也表達胰高血糖素基因［9］，但有關胰高血糖素基因在胰島素瘤形成中的作用鮮見報道。本研究擬采用本課題組已經成功構建的胰島素瘤裸鼠模型［9］，觀察敲降胰高血糖素基因對胰島素瘤形成的影響，為進一步探討胰島素瘤的發病機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料 （1）細胞。大鼠胰島素瘤細胞系（INS-1細胞）、大鼠胰島α細胞系（INR-1G9細胞）、INS-1細胞的單細胞克隆（r9細胞）、人胰島素瘤細胞、293T細胞、人近端腎小管上皮細胞系（HK-2細胞），上述細胞系均由中日友好醫院臨床醫學研究所婁晉寧教授惠贈。（2）實驗動物。nu/nu裸鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號SCXK（京）2006-0009，6～8周齡，體質量20～25 g，均為雄性，無特定病原體（specific pathogen free，SPF）條件下飼養。（3）主要試劑與儀器。1640培養基、胎牛血清（FCS）均購自美國GIBCO公司，胰蛋白酶、鏈脲佐菌素、氨芐青霉素均購自美國Sigma公司，葡萄糖購自中國大冢制藥有限公司，精氨酸購自上海信誼藥業有限公司，去甲腎上腺素、乙酰膽堿（TGI）均購自上海禾豐制藥有限公司，胰島素（insulin）ELISA試劑盒、ECL化學發光試劑均購自美國Millipore公司，胰高血糖素（glucagon）放射免疫分析試劑盒購自中國原子高科股份有限公司，兔抗insulin多克隆抗體、羊抗glucagon多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司，總RNA提取試劑盒、質粒中提試劑盒均購自美國Promega公司，BCA法蛋白測定試劑盒購自碧云天生物技術公司，T4 DNA連接酶購自寶日醫生物技術有限公司，HB101化學感受態細胞購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司，pLVTHM-shglucagon慢病毒質粒與輔助質粒psPAX2、pMD2.G由中日友好醫院臨床醫學研究所婁晉寧教授惠贈。ELX800自動酶標儀購自美國Bio-Tek公司，紫外凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司，SN-6105γ放射免疫計數器購自上海核所日環光電儀器有限公司，全自動激光共聚焦顯微鏡1X81購自日本Olympus公司。

1.2細胞培養 INS-1細胞、INR-1G9細胞、r9細胞和人胰島素瘤細胞用1640培養基（內含10%胎牛血清，青霉素/鏈霉素1.0×104U/L，5.5 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L HEPES，50μmol/L β-巰基乙醇，1 mmol/L丙酮酸鈉），其中r9細胞培養時另外添加100 mg/L G418；HK-2細胞用DMEM/F12培養基（內含10%胎牛血清，青霉素/鏈霉素1.0×104U/L），各種細胞于5%CO2，37℃培養。待細胞生長至融合度為90%時用0.025%胰蛋白酶/EDTA傳代。

1.3激光共聚焦顯微鏡觀察INS-1細胞胰島素和胰高血糖素的表達 將INS-1細胞（1×105/孔）、人胰島素瘤細胞（5×104/孔）和HK-2細胞（5×104/孔）接種于激光共聚焦專用的培養皿中，72 h后吸去細胞培養液，PBS洗2次，4%多聚甲醛室溫固定細胞20 min，PBS洗2次后，用0.1%Triton X-100+0.1%檸檬酸鈉冰上通透8 min，PBS洗2次后，0.1%BSA/PBS/Tween 20室溫封閉20 min。PBS洗2次，然后用1∶80稀釋的兔抗鼠胰島素抗體4℃孵育過夜。PBS洗2次后，用1∶50稀釋的cy3標記的羊抗兔一抗，37℃孵育50 min，PBS洗3次。然后加入1∶80稀釋的羊抗鼠胰高血糖素抗體，37℃孵育60 min，PBS洗2次，再加入1∶150稀釋的FITC標記的兔抗羊二抗，37℃孵育50 min，用PBS洗3次，激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光的強弱并拍照，激發波長488 nm，發射波長520 nm。

1.4胰高血糖素基因敲降

1.4.1pLVTHM-shglucagon慢病毒載體構建 Shglucagon（Gcg glucagon［Rattus norvegicus］Gene ID：24952）質粒由華大基因合成。pLVTHM-shglucagon正義鏈：5'-CGCGTACTAGTCCCCGGAAGAAGTCGCCATAGCTGATTCA AGAGATCAGCTATGGCGACTTCTTCCTTTTTGGAAAT-3'，反義鏈：5'-CGATTTCCAAAAAGGAAGAAGTCGCCATAGCT GATCTCTTGAATCAGCTATGGCGACTTCTTCCGGGGACTAG TA-3'，通過Oligo退火合成shDNA，在T4 DNA連接酶作用下，與退火的DNA oligo于4℃連接16 h，轉化大腸桿菌感受態細胞后，送上海生工生物工程股份有限公司進行陽性鑒定。用磷酸鈣-DNA共沉淀法共轉染至病毒包裝細胞HEK-293T，進行慢病毒顆粒的包裝。感染前24 h，調整293T細胞密度為2×106/L，接種于T75細胞培養瓶，37℃、5%CO2培養箱內培養，待細胞密度達60%～70%時即可感染。3種質粒［pLVTHM-shglucagon（同時可表達綠色熒光蛋白）20μg、pMD2G 5μg和psPAX2 15μg］按比例混合后用無菌去離子水調到250μL，加入250μL 0.5 mol/L CaCl2混合均勻，然后逐滴緩慢加入500μL 2×HeBS，以最大速度渦旋混勻。實驗臺上靜置30 min，然后稀釋到10 mL新鮮培養基中，加入培養瓶，溫和振動培養瓶使沉淀物均勻分布到細胞單層上。培養24 h后棄去培養液，加入15 mL新鮮培養液繼續培養，分別于轉染48 h和72 h后收集細胞上清培養基，4℃，3 000 r/min離心10 min收集上清并用0.45μm微孔濾膜過濾除菌，慢病毒上清分裝到5 mL無菌EP管中，-80℃保存，可以直接用于轉導目的細胞。同樣方法制備僅含綠色熒光蛋白（GFP）報告基因的陰性對照慢病毒載體。

1.4.2慢病毒感染INS-1細胞 將上述分裝的慢病毒上清從-80℃冰箱取出，慢病毒上清與目的細胞培養基的混合比例為1∶2或1∶3，轉導INS-1細胞4～6 h后更換新鮮培養基。根據感染情況將同時間點的INS-1細胞分為3組：空白對照組，不進行感染，其他培養條件同各感染組；單純轉染慢病毒（N-pLV）組，感染pLVTHM，即只含有GFP；敲降胰高血糖素（N-pLV-G）組，感染pLVTHM-shglucagon。48 h在熒光顯微鏡下觀察目的細胞熒光強弱可以初步判斷慢病毒是否感染成功，繼續培養至60 d，分別觀察30 d、60 d時細胞的熒光強弱變化。

1.4.3RT-PCR檢測胰高血糖素基因的表達 將3組細胞以2×105/mL的密度接種于24孔培養板中，每組細胞設置5個復孔，應用正常培養基培養3 d后收集各組細胞，應用Promega試劑盒提取細胞總RNA，并反轉錄成cDNA。擴增引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成。胰高血糖素基因的引物序列：上游5'-GTTTACATCGTGGCTGGATTG-3'，下游5'-TGAATTCCTTTGCTGCCTGGC-3'，擴增片段 349 bp。參照Promega RT-PCR system試劑盒說明書進行反轉錄和PCR擴增，50μL反應體系添加0.1μg模板，上、下游引物的終濃度分別為1μmol/L。PCR反應條件：95℃預變性4 min；94℃變性15 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環，72℃延伸3 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統掃描采集圖像。

1.4.4Western blot檢測胰高血糖素蛋白的表達水平 將3組細胞以1×105分別接種6孔培養板，3 d后收集并裂解細胞，提取總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測總蛋白量。樣本經10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（120 V恒壓）分離，然后按照200 mA恒流電轉移70 min，將蛋白自凝膠轉印至PVDF膜。PVDF膜經去離子水清洗后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，然后加入1∶500稀釋的羊抗鼠胰高血糖素抗體，4℃孵育過夜，TBST漂洗后用1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的抗羊IgG二抗孵育1.5 h，漂洗后用ECL化學發光試劑盒增強發光，X線片顯影。利用美國Bio-Rad公司紫外凝膠成像系統對X線片上的條帶進行平均光密度（IOD）值測量。以βactin作為內參。實驗重復3次。

1.4.5細胞分泌功能的檢測 將3組細胞分別種于24孔板，2×106/孔中，每組3個平行孔。培養72 h后，用含2.5 mmol/L葡萄糖（glucose）的培養基平衡5 h，然后用KRBH（Krebs-Ringer bicarbonate HEPES buffer）液洗2次，分別加入2.5、20 mmol/L glucose的KRBH 0.5 mL，并加入抑肽酶使其終濃度為1 mg/L，刺激細胞2 h，收集上清液，用于胰島素和胰高血糖素測定。胰島素測定采用ELISA法，胰高血糖素的測定采用放射免疫分析法，均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.6MTT法檢測細胞的增殖能力 將空白對照組、單純轉染慢病毒組和敲降胰高血糖素組細胞以9×103/孔分別種于96孔板中，用培養液調整每孔終體積為200μL，每個濃度設置6個復孔，分別在培養第0、1、3、5、7天從培養箱中取出培養板測量細胞量，首先輕輕吸出每孔培養液，然后每孔加入濃度為5 g/L的MTT溶液30μL，37℃繼續孵育4 h，小心吸去每孔內培養液之后，每孔加入150μL DMSO，輕輕振蕩，槍頭吹吸混勻，待細胞內結晶紫完全溶解后，在ELX800自動酶標儀設置波長492 nm處讀取每孔光密度（OD）值。每個實驗重復3次。

1.4.7體內實驗 利用本課題組已成功構建的大鼠胰島素瘤動物模型［9］。首先刮取3組細胞，將其分別移植到裸鼠左腎包膜下，在0、1、2、3、4、5、6周監測血糖變化。實驗第45天處死動物，取出雙側腎臟，肉眼觀察比較不同組動物腎臟大小并拍照。然后進行免疫組織化學染色。即取部分移植部位腎臟經10%福爾馬林液固定后，制備石蠟切片，經常規脫蠟、水化，微波熱修復，3%過氧化氫溶液封閉內源性過氧化物酶。一抗分別使用兔抗鼠胰島素抗體、羊抗鼠胰高血糖素抗體，4℃孵育過夜，二抗使用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體或兔抗羊IgG抗體，37℃30 min，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木精復染，脫水、透明封片后鏡檢，采用Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統分析免疫組織化學染色樣本的IOD值。

1.5統計學方法 數據應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗；2組間比較采用t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1胰島素瘤細胞的特性分析 激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，INS-1細胞和人胰島素瘤細胞同時表達胰島素和胰高血糖素；但作為對照的腎小管上皮細胞HK-2細胞中兩者都不表達。見圖1。

2.2胰高血糖素在胰島素瘤形成中的作用

2.2.1INS-1細胞胰高血糖素基因敲降株的建立 pLVTHM與包裝質粒共轉染293T細胞48 h后，細胞表達較強的GFP（圖2A），表明慢病毒包裝成功。將包裝好的病毒感染INS-1細胞后，INS-1細胞表達GFP（圖2B），隨著傳代培養時間的延長，在30 d（圖2C）和60 d（圖2D）時檢測發現GFP的表達無明顯變化，而與單純轉染慢病毒組相比，敲降后INS-1細胞中胰高血糖素mRNA（IOD，0.53±0.14vs.1.37±0.42，t=3.184，P＜0.05）和蛋白表達水平（IOD，0.28±0.06vs.0.96±0.12，t=4.351，P＜0.05）均明顯降低（圖3），說明胰高血糖素基因敲降成功。

Fig.1 The expressions of insulin and glucagon in cells of each group(Immunofluorescence staining,×1 500)圖1 各組細胞胰島素和胰高血糖素基因的表達（免疫熒光染色，×1 500）

Fig.2 The glucagon gene knock down in INS-1 cells(×200)圖2 INS-1細胞中胰高血糖素基因的敲降（×200）

Fig.3 Effects of glucagon gene knockdown on INS-1 cells圖3 INS-1細胞胰高血糖素基因的敲降效果

2.2.2敲降胰高血糖素對INS-1細胞分泌功能的影響 敲降INS-1細胞胰高血糖素基因72 h后，3組低濃度（2.5 mmol/L）和高濃度（20 mmol/L）葡糖糖刺激的胰島素的分泌未見明顯變化（P＞0.05）；敲降胰高血糖素組低濃度、高濃度葡糖糖刺激的胰高血糖素分泌較空白對照組和單純轉染慢病毒組明顯降低（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Effects of glucagon knockdown gene on insulin and glucagon secretion in INS-1 cells stimulated by different concentrations of glucose表1 敲降胰高血糖素基因對不同濃度葡萄糖刺激INS-1細胞胰島素和胰高血糖素分泌功能的影響 （μg/L，n=3，±s）

Tab.1 Effects of glucagon knockdown gene on insulin and glucagon secretion in INS-1 cells stimulated by different concentrations of glucose表1 敲降胰高血糖素基因對不同濃度葡萄糖刺激INS-1細胞胰島素和胰高血糖素分泌功能的影響 （μg/L，n=3，±s）

＊P＜0.05；a與空白對照組比較，b與單純轉染慢病毒組比較，P＜0.05

組別空白對照組N-pLV組N-pLV-G組F胰島素2.5 mmol/L 11.06±1.06 12.29±0.83 11.55±0.88 1.298 20 mmol/L 48.59±2.45 52.09±2.25 55.14±3.87 6.075胰高血糖素2.5 mmol/L 73.45±5.25 78.24±2.50 31.70±1.84ab 158.699＊20 mmol/L 694.79±16.85 692.33±12.30 285.57±15.25ab 749.93＊

2.2.3敲降胰高血糖素對INS-1細胞增殖能力的影響 MTT結果顯示，與空白對照組相比，轉染空載慢病毒對細胞增殖能力無明顯影響（P＞0.05），但敲降胰高血糖素基因可以明顯降低INS-1細胞的增殖能力（P＜0.05），見圖4。

Fig.4 Effects of glucagon knockdown on proliferation of INS-1 cells圖4 敲降胰高血糖素對INS-1細胞增殖能力的影響

2.2.4體內移植 3組裸鼠血糖在移植第1、2周時的差異無統計學意義；移植第3、4、5周時，3組血糖逐漸下降，但敲降胰高血糖素組血糖仍高于同時期的空白對照組和單純轉染慢病毒組（P＜0.05）；至移植第6周時3組血糖差異無統計學意義，見圖5。腎臟大體形態觀察結果顯示，敲降胰高血糖素組腎臟腫瘤較單純轉染慢病毒組有所減小，見圖6。免疫組化染色結果顯示，與單純轉染慢病毒組相比，敲降胰高血糖素組細胞胰島素（IOD）的表達未見明顯變化（1.67±0.29vs.1.58±0.32，t=0.361，P＞0.05），而胰高血糖素（IOD）表達降低（0.43±0.08vs.1.51±0.24，t=7.394，P＜0.05），見圖7。

Fig.5 The changes of blood glucose in INS-1 cells after glucagon knockdown and transplanted into the left kidney capsule of nude mice圖5 敲降胰高血糖素基因細胞移植到裸鼠左腎包膜下后血糖水平的變化

Fig.6 Tumorigenicity after glucagon knockdown in INS-1 cells and transplanted into the left kidney capsule圖6 敲降胰高血糖素基因細胞移植到裸鼠左腎包膜下后的成瘤情況

3 討論

胰島素瘤起源于胰島β細胞，約87%屬于良性腫瘤［10］，其中具有胰島素分泌功能的功能性胰島素瘤約占80%［11］，因其過量分泌胰島素可導致反復低血糖，甚至可引起腦細胞損傷。由于其臨床表現復雜多樣，臨床上極易誤診、誤治［4-5］，且目前其發病機制尚不明確。

本課題組前期研究發現，大鼠胰島素瘤細胞系INS-1細胞和人胰島素瘤細胞既表達胰島素，同時也表達胰高血糖素［9］。但關于胰高血糖素基因是否影響胰島素瘤形成的報道較少。有研究顯示，正常情況下，胰島α細胞對胰島β細胞的存活和胰島素分泌具有支持作用［12］，并且胰高血糖素對胰島β細胞的增殖和胰島素分泌也有一定的促進作用［13］。INS-1細胞系來自胰島β細胞經過放射線照射誘導成的胰島β細胞瘤，具有胰島β細胞的絕大部分功能，可對葡萄糖刺激做出反應而分泌大量胰島素。本研究結果顯示，INS-1細胞不僅表達胰島素而且表達胰高血糖素，與本課題組前期研究結果一致［9］。

為了進一步探討胰高血糖素基因在胰島素瘤形成中的作用，本研究利用慢病毒介導的基因敲降系統建立了胰高血糖素敲降的INS-1細胞株。由于基因敲降所使用的載體pLVTHM不僅能在宿主細胞中持續表達shRNA，而且表達GFP，因此本研究利用細胞表達GFP的情況初步判斷細胞轉染效率。細胞免疫熒光染色、RT-PCR及Western blot結果顯示，慢病毒介導的基因敲降系統可明顯降低INS-1細胞中胰高血糖素基因的表達水平，并且不隨細胞傳代和增殖而發生改變，說明本研究成功構建了穩定敲降的胰高血糖素基因的INS-1細胞系。體外實驗發現敲降胰高血糖素基因可降低INS-1細胞胰高血糖素的分泌，而對胰島素分泌功能無明顯影響，并且敲降胰高血糖素基因可明顯降低INS-1細胞的增殖能力，提示體外敲降胰高血糖素基因可抑制胰島素瘤細胞的增殖。之后，本研究利用本課題組前期已成功構建的胰島素瘤動物模型，進一步探討胰高血糖素基因敲降在動物整體水平上對胰島素瘤形成的影響［9］，該胰島素瘤模型具有臨床胰島素瘤的特點，適合用于對胰島素瘤的深入研究。

本研究結果顯示，與單純轉染慢病毒組相比，移植敲降胰高血糖素基因細胞的裸鼠血糖下降較慢，形成的腫瘤體積也較小。移植瘤免疫組織化學染色結果顯示，敲降胰高血糖素基因細胞移植組裸鼠移植瘤細胞胰島素的表達未見明顯變化，而胰高血糖素表達明顯降低，提示敲降胰高血糖素基因可在一定程度上抑制胰島素瘤細胞的增殖，使腫瘤體積較小，并且能減少胰島素的釋放，使裸鼠血糖下降較慢。筆者推測胰島素瘤的生長可能與胰高血糖素基因表達水平有關。

Fig.7 Immunohistochemical staining of transplantation site after transplantation of knockdown of glucagon gene cells(×200)圖7 敲降胰高血糖素基因細胞移植后移植部位的免疫組化染色（×200）