輔酶Q10對人RPE細胞氧化應激損傷的保護作用及機制研究

鄧瑩瑩，丁慰祖

(上海市第八人民醫院眼科，上海 200235)

輔酶Q10，又名泛醌，是一種類維生素作用物質，脂溶性分子，為抗氧化作用非常強的抗氧化劑。輔酶Q10是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，是廣泛存在于生物體內的各類細胞中的一種化合物，在體內發揮著非常重要的作用[1]。研究[2-3]表明，輔酶Q10具有抗氧化作用，能回收利用維生素E，清除體內自由基；增強機體的體液和細胞免疫；對體內的腫瘤細胞具有一定的殺傷作用；且能夠明顯緩解機體疲勞，提高運動機能；對心腦血管疾病有預防和治療作用。近年來，研究[4-5]還發現輔酶Q10對老年人的視網膜疾病的治療有一定的療效。青光眼、年齡相關性黃斑變性等多種眼科疾病的發生與多種因素有關，包括視網膜衰老、眼壓升高、營養、遺傳、環境、機械性損傷、氧化損傷等，而其中的氧化損傷在老年人眼科疾病的發生中占有非常重要的作用，因而越來越受人們的關注。然而，輔酶Q10對視網膜上皮細胞的作用效果是否為直接作用，以及其可能的作用機制等問題并未得到全面揭示，這些問題的深入研究將有望為此類疾病的診療提供思路。本研究采用人視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelial cell，RPE)作為研究對象，采用輔酶Q10進行干預，使用藥物梯度實驗明確Q10對RPE是否具有保護性作用，并采用分子免疫學等技術從細胞氧化應激損傷、凋亡等角度分析輔酶Q10的可能作用機制，為輔酶Q10對老年人眼科疾病的預防與治療提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞處理

人視網膜色素上皮細胞株RPE-19(購自中山大學眼科中心)置于37 ℃培養箱(5% CO2)中，用含10%小牛血清的DMEM培養液中進行培養。實驗分為4組，氧化應激模型組，細胞在200 μmol/L的H2O2溶液中培養2 h；試驗組分為兩組，10 μmol/L輔酶Q10組、1 μmol/L輔酶Q10組，兩組細胞分別經10 μmol/L、1 μmol/L輔酶Q10培養48 h后，繼續在200 μmol/L的H2O2溶液中培養2 h；正常對照組細胞，不加輔酶Q10和H2O2處理。

1.2 細胞活性檢測

細胞活性檢測采用CCK-8法進行，在4組細胞中加入10%CCK-8工作液，同時設立對照組，然后置于培養箱中孵育30 min，在450 nm波長下利用酶標儀測定每孔的OD值，每組設6復孔，實驗重復3次。

1.3 細胞內活性氧檢測

細胞內活性氧采用DCFH-DA熒光探針檢測法進行，4組細胞用DCFH-DA活性氧熒光檢測試劑盒(購自蘇州碧云天生物公司)檢測ROS表達量，實驗重復3次。

1.4 細胞中 Caspase-3、Bcl-2、Bax、磷酸化-Akt、Akt的檢測

采用Western blot法檢測細胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax、磷酸化-Akt、Akt的表達，提取經過不同處理的4組細胞蛋白質，應用BCA法測定蛋白濃度。將各組蛋白樣品進行電泳分離，同時加入蛋白Marker，進行軟膜，脫脂奶粉封閉，順序加入一抗、二抗，曝光，膠片掃描，用Image J 軟件對條帶進行灰度分析。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 輔酶Q10對人視網膜色素上皮細胞RPE-19活性的影響

H2O2處理后的細胞的活性明顯下降，且均低于正常對照組(P<0.05)。經輔酶Q10預處理的細胞，其細胞活性明顯高于單純用H2O2處理的模型組細胞，1 μmol/L輔酶Q10組和10 μmol/L輔酶Q10組與氧化應激模型組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 輔酶Q10對人視網膜色素上皮細胞RPE-19活性的影響

*P<0.05，與正常對照組比較；#P<0.05，與氧化應激模型組比較。

2.2 輔酶Q10對人視網膜色素上皮細胞RPE-19活性氧的影響

H2O2處理后的細胞內活性氧的含量明顯增高，且高于正常對照組(P<0.05)。經輔酶Q10預處理的細胞，其細胞內活性氧的水平明顯低于單純用H2O2處理的模型組細胞內活性氧水平，1 μmol/L輔酶Q10組和10 μmol/L輔酶Q10組與氧化應激模型組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 輔酶Q10對人視網膜色素上皮細胞RPE-19活性氧的影響

*P<0.05，與正常對照組比較；#P<0.05，與氧化應激模型組比較。

2.3 輔酶Q10對人視網膜色素上皮細胞Caspase-3、Bcl-2、Bax、磷酸化-Akt、Akt的表達影響

輔酶Q10能夠抑制H2O2誘導人視網膜色素上皮細胞中Caspase-3、Bax的表達，促進可以抑制凋亡的Bcl-2的表達，H2O2可以使細胞中的Caspase-3、Bax的表達量升高，且抑制Bcl-2的表達。與氧化應激模型組比較，1 μmol/L輔酶Q10組和10 μmol/L輔酶Q10組細胞中Caspase-3、Bax的表達量低于氧化應激模型組，Bcl-2的表達量高于氧化應激模型組。H2O2還可誘導Akt的磷酸化，1 μmol/L輔酶Q10組和10 μmol/L輔酶Q10組的磷酸化-Akt的表達量低于氧化應激模型組。見圖1。

3 討論

伴隨著社會老齡化的加劇，老年性眼病呈現高發的趨勢，與年齡相關性黃斑變性、青光眼、白內障等多種眼病均引起嚴重的視力障礙，嚴重者會導致患者永久失明[6-8]。而引起這些眼部疾病的最重要的一個因素就是氧化應激，如果能夠預防和治療氧化應激，對于控制這些眼部疾病的發生和治療均具有非常重要的意義。

輔酶Q10是生物體內的一種抗氧化劑物質，天然存在于機體內，已在臨床上廣泛地應用于許多疾病的預防和治療[9-11]。輔酶Q10在體內各種組織和器官中的含量隨著年齡的增長而降低，因此其生理作用能力相應的下降，與多種慢性疾病的發生均有關系。通過外源補充輔酶Q10可以提高其在體內的水平，有助于其在體內發揮抗氧化作用，預防一些慢性疾病的發生[12-13]。

關于輔酶Q10在眼部疾病發生、發展中的作用研究較少，本研究應用輔酶Q10預處理人視網膜色素上皮細胞，然后用H2O2誘導氧化損傷，探討輔酶Q10對人RPE細胞氧化應激損傷的保護作用及機制研究。結果表明，輔酶Q10能夠增強H2O2處理后的視網膜色素上皮細胞的活性；降低由于H2O2引起的細胞內活性氧的水平。臨床上多種眼科疾病與視網膜上皮細胞氧化應激密切相關，如老年性白內障、糖尿病視網膜病變等，輔酶Q10抗上皮氧化作用提示具有潛在的臨床應用價值。同時，本研究顯示輔酶Q10具有抑制人視網膜色素上皮細胞中Caspase-3、Bax的表達，促進細胞中Bcl-2的表達水平的作用。輔酶Q10體外干預具有抑制視網膜上皮凋亡的效果，這可能是其療效機制之一。而Akt是調控凋亡的重要信號，輔酶Q10干預顯著抑制了人視網膜色素上皮細胞中Akt的磷酸化水平，提示輔酶Q的可能作用機制為抑制Akt信號。

綜上，本研究采用體外研究的方法，證實了輔酶Q10對人RPE細胞氧化應激損傷的保護作用機制。這可能是通過細胞發生氧化損傷，抑制與凋亡發生相關因子的表達(如caspase-3、Bax等)，促進凋亡抑制因子Bcl-2表達，抑制Akt發生磷酸化等多個方面起作用。