槲皮素抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的體內(nèi)外活性研究

周孟，廖祥明，王珊，鞏仔鵬，張榮紅

惡性腫瘤是我國乃至全球最為主要的公共健康問題之一。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國腫瘤總體5年生存率較低，僅為30.9%，與發(fā)達(dá)國家相比尚有明顯差距［1］。槲皮素（Quercetin，Qu）屬于黃酮類，廣泛分布于多種蔬菜（洋蔥、姜、芹菜等）、水果（蘋果、草莓等）和中草藥（銀杏、三七、槐米等）中［2］。人體對(duì)Qu具有良好的耐受性，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)已于1999將Qu歸入對(duì)人無致癌性物質(zhì)之列，可將Qu作為有益健康的食品補(bǔ)充劑使用［3］。Qu具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗感染、免疫抑制、心血管保護(hù)和血糖調(diào)節(jié)等［4］。抗腫瘤活性方面，Qu可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、干擾腫瘤細(xì)胞周期和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥等作用［5-6］，對(duì)多種惡性腫瘤如肝癌、胃癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、卵巢癌及膽囊癌等均有較好抑制作用［7］。其中，以抗肝癌活性尤為顯著，而原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，在我國近20年來其死亡率增加了41.17%，已成為我國第二位腫瘤病因。Qu可阻滯肝癌細(xì)胞周期，抑制肝癌細(xì)胞生長，具有顯著的抗癌活性［8］，然而具體的抗腫瘤機(jī)制目前尚未完全明確［4］。并且，同時(shí)評(píng)價(jià)Qu體內(nèi)外抗HepG2細(xì)胞活性及對(duì)凋亡的影響也未見報(bào)道。因此，本研究自2017年1月至2018年1月分別通過體外直接抑制HepG2細(xì)胞及體內(nèi)抑制皮下移植腫瘤模型來考察Qu對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制活性，并進(jìn)一步分析了Qu對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響，為明確Qu的抗肝癌作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞與動(dòng)物 人肝癌細(xì)胞株HepG2購置于美國ATCC，并由四川大學(xué)生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；雌性裸鼠（Balb/C nu/nu），4～6周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2015-0004；動(dòng)物處置符合倫理學(xué)原則。

1.1.2試劑 Qu（100 mg，批號(hào)051K1225）購自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）均購自美國GIBCO公司；胰蛋白酶（trypsin）、注射用順鉑（Cisplatin）均購自云南個(gè)舊生物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品（批號(hào)150301），臨用前用0.9%氯化鈉溶液稀釋；5%葡萄糖注射液購自太極集團(tuán)西南藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品（批號(hào)15081073）；氯化鈉注射液（0.9%）購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品（批號(hào)M15062317）。體外用Qu用二甲基亞砜（DMSO）稀釋成儲(chǔ)存液凍存。使用時(shí)用DMEM培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，DMSO體積百分?jǐn)?shù)＜0.1%；體內(nèi)用Qu溶解在PEG400里，臨用時(shí)用0.9%氯化鈉溶液稀釋成所需濃度。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置飽和濕度、37℃的5%CO2孵箱中培養(yǎng)。此細(xì)胞貼壁生長。

1.2.2細(xì)胞計(jì)數(shù) 體外培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化、吹打脫落并混勻后，用0.9%氯化鈉溶液稀釋到合適的密度。混勻后吸取少量懸液滴加到血球計(jì)數(shù)板上，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)。記下4個(gè)大格的細(xì)胞總數(shù)，取平均數(shù)后乘以104，再乘以稀釋倍數(shù)得到細(xì)胞密度，乘以總體積即得到細(xì)胞總數(shù)。

1.2.3MTT試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，消化液消化或直接吹打混勻后計(jì)數(shù)；調(diào)整細(xì)胞懸液濃度每毫升3×104，于96孔板中每孔加入100μL細(xì)胞懸液；24 h后吸掉原有培養(yǎng)基，分別加入200μL含有Qu的完全培養(yǎng)液（陰性對(duì)照組加等量DMSO），每組5孔，繼續(xù)培養(yǎng)于CO2孵箱；分別于加藥后24、48和72 h后取出96孔板，每孔加入5 mg/L MTT試劑20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸出孔中的液體，每孔加入150μL DMSO，室溫震蕩15 min充分溶解沉淀，用酶標(biāo)儀在570 nm波長檢測每孔細(xì)胞OD值。

根據(jù)相對(duì)抑制率判斷Qu對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用：

相對(duì)抑制率＝（對(duì)照孔平均OD值-加藥孔平均OD值）÷對(duì)照孔平均OD值×100%。

1.2.4HepG2細(xì)胞裸鼠皮下移植模型的建立

HepG2細(xì)胞長到80%～90%匯合度時(shí)，用0.25%的胰酶消化后離心，加無血清培養(yǎng)基懸浮，用血球計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。離心后用無血清漂洗一次，然后再次離心。去掉培養(yǎng)基后，加入合適體積的無血清DMEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)到每毫升108個(gè)細(xì)胞懸液，在注射之前置于冰上。混勻細(xì)胞懸液，用1 mL注射器往裸鼠右側(cè)flank位置皮下注射100μL細(xì)胞懸液（107個(gè)細(xì)胞）。接種后一周左右，待腫瘤長到3 mm×3 mm時(shí)，進(jìn)行隨機(jī)分組。

1.2.5移植瘤種植及藥物治療 接種后待腫瘤直徑長至6 mm以上時(shí)，淘汰腫瘤體積過大、過小的荷瘤裸鼠，將合格動(dòng)物采用隨機(jī)數(shù)字表法分組，實(shí)驗(yàn)設(shè)0.9%氯化鈉溶液陰性對(duì)照組，腹腔注射給藥Qu低（12.5 mg/kg）、中（25 mg/kg）、高劑量組（50 mg/kg），陽性藥順鉑組（5 mg/kg），共5組，每組6只荷瘤裸鼠。分組后次日第一次給藥，Qu組給藥頻率為每2 d腹腔注射給藥一次；陽性藥順鉑組（5 mg/kg）為每5 d腹腔注射給藥。

1.2.6觀察指標(biāo)和有效判定標(biāo)準(zhǔn) 從分組當(dāng)天開始，對(duì)小鼠體質(zhì)量和腫瘤大小進(jìn)行測量，并對(duì)可能存在的藥物毒性進(jìn)行觀察。

（1）體質(zhì)量測量：置于電子天平上測量，結(jié)果精確到0.1 g。同時(shí)觀察毒性反應(yīng)，治療期間觀察小鼠對(duì)藥物的反應(yīng)，如皮毛色澤、立毛反應(yīng)、食欲及活躍程度等。

（2）腫瘤體積（TV）、相對(duì)腫瘤體積（RTV）和相對(duì)腫瘤增殖率：每2天用1/50 mm精度游標(biāo)卡尺測腫瘤的長徑和短徑，動(dòng)態(tài)觀察受試藥抗腫瘤的效應(yīng)。TV的計(jì)算公式為：TV（mm3）＝a×b2×π/6

其中a、b分別表示長徑和短徑。根據(jù)測量的結(jié)果計(jì)算出RTV，計(jì)算公式為：RTV＝Vt/V0，其中V0為每一組在分籠給藥時(shí)（即d0）測量所得TV，Vt為該組每一次測量時(shí)的TV。抗腫瘤活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)為相對(duì)腫瘤增值率T/C（%），計(jì)算公式如下：

TRTV：治療組相對(duì)腫瘤體積；CRTV：陰性對(duì)照組相對(duì)腫瘤體積。

療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：T/C（%）＞60為無效；T/C（%）≤60，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P＜0.05為有效。

（3）腫瘤重量測定及抑瘤率（%）的計(jì)算：于治療終點(diǎn)時(shí)處死動(dòng)物，解剖剝離瘤塊，稱瘤重，并照像。按下式計(jì)算腫瘤生長抑制率：

有效判定標(biāo)準(zhǔn)：抑瘤率（即腫瘤生長抑制率）＜40%為無效；抑瘤率≥40%并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P＜0.05為有效。

（4）綜合判定標(biāo)準(zhǔn)：上述2項(xiàng)有效判定標(biāo)準(zhǔn)（相對(duì)腫瘤增殖率和抑瘤率）中，有一項(xiàng)符合有效標(biāo)準(zhǔn)判為有效。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0和GraphPad Prism 5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外Qu對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響為了測試Qu對(duì)腫瘤細(xì)胞HepG2的直接作用，實(shí)驗(yàn)中使用MTT法對(duì)比分析了不同濃度的Qu（0，10，20，40，80和160 μmol/L）在不同時(shí)間（24，48，和72 h）對(duì)體外腫瘤細(xì)胞HepG2增殖的影響（圖1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著檢測時(shí)間的延長，Qu對(duì)HepG2的抑制活性也逐漸增強(qiáng)（圖1A），24，48和72 h的IC50分別為110.50，63.73和46.38μmol/L（圖1B），可見Qu對(duì)肝癌細(xì)胞的生長和增殖具有時(shí)間和濃度依乘抑制效果。

2.2 Qu對(duì)HepG2肝癌裸鼠皮下移植瘤的影響

2.2.1Qu對(duì)腫瘤體積與動(dòng)物體質(zhì)量的影響 通過測試不同濃度（12.5，25和50 mg/kg）的Qu對(duì)HepG2人肝癌裸鼠皮下移植瘤腫瘤體積的影響（圖2A），發(fā)現(xiàn)Qu能夠顯著抑制HepG2在體內(nèi)的增殖，且呈濃度依賴性。尤其是當(dāng)Qu給藥濃度為50 mg/kg時(shí)，在前12 d內(nèi)其抑制活性較陽性藥物順鉑更好；在第12～18天之間，活性與陽性藥物順鉑相當(dāng)。在動(dòng)物體質(zhì)量方面，各濃度Qu組的動(dòng)物體質(zhì)量與空白對(duì)照組幾乎相同，而順鉑組體質(zhì)量下降非常明顯（圖2B），在第20天體質(zhì)量下降接近30%，并導(dǎo)致了其中一只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡。在第21天處死動(dòng)物后，可以觀察到順鉑組腫瘤體積顯著受到抑制。各濃度的Qu組的腫瘤體積明顯小于空白對(duì)照組（圖3），并且隨著Qu濃度的提升，腫瘤體積也相應(yīng)減小，但相對(duì)于陽性藥物順鉑抑瘤效果略差。

2.2.2Qu對(duì)RTV值的影響 經(jīng)測量裸鼠瘤體積與第1天給藥時(shí)瘤體積計(jì)算RTV值，結(jié)果見表1。可見，與0.9%氯化鈉溶液組相比，Qu各劑量組和順鉑組均在第6至10天開始差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HepG2腫瘤體積受到顯著抑制，且Qu各劑量組比陽性藥略好。第12至20天與0.9%氯化鈉溶液陰性對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組也顯著抑制腫瘤增殖，并且50 mg/kg Qu活性與陽性組相當(dāng)，而中、低劑量組活性稍差。

圖1 不同檢測時(shí)間（24，48，及72 h）下槲皮素對(duì)HepG 2細(xì)胞的抑制曲線（A）與IC50值（B）

圖2 槲皮素對(duì)HepG2人肝癌皮下移植瘤腫瘤體積（A）與模型老鼠體質(zhì)量（B）的影響

圖3 腹腔注射不同藥物后，第21天HepG2人肝癌裸鼠皮下腫瘤模型動(dòng)物（A）與腫瘤（B）

2.2.3Qu對(duì)移植瘤腫瘤抑瘤率與相對(duì)增殖率的影響 進(jìn)一步分析各組腫瘤的抑瘤率與腫瘤相對(duì)增值率可以發(fā)現(xiàn)，陽性藥物順鉑對(duì)HepG2細(xì)胞裸鼠皮下腫瘤模型的抑瘤率為59.59%（表2），大于40%，與空白對(duì)照相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；并且其相對(duì)腫瘤增殖率為38.07%（表3），小于60%，兩組數(shù)據(jù)均表明順鉑對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞裸鼠皮下腫瘤具有明顯的抑制作用。50 mg/kg Qu組對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞裸鼠皮下腫瘤模型的抑瘤率為46.65%，大于40%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；并且相對(duì)其腫瘤增殖率為46.68%，小于60%，兩組數(shù)據(jù)均表明50 mg/kg的Qu對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞表現(xiàn)出較理想的抑制效果。25 mg/kg Qu對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞裸鼠皮下腫瘤模型的抑瘤率為40.23%，大于40%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；并且其相對(duì)腫瘤增殖率為52.58%，小于60%，兩組數(shù)據(jù)也表明25 mg/kg的Qu在人肝癌HepG2細(xì)胞裸鼠皮下腫瘤模型上表現(xiàn)出一定抑制效果。然而12.5 mg/kg Qu對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞裸鼠皮下腫瘤模型的抑瘤率為11.22%，小于40%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且其相對(duì)腫瘤增殖率為75.30%，大于60%，則表明12.5 mg/kg的Qu在人肝癌HepG2細(xì)胞裸鼠皮下腫瘤模型中抑制作用較弱。綜上可知Qu在體內(nèi)對(duì)HepG2肝癌的抑癌作用呈濃度依賴性，在中、高濃度表現(xiàn)較為顯著的抑制作用，并且在高濃度（50 mg/kg）時(shí)與陽性藥物順鉑活性相當(dāng)。然而考慮到順鉑極為明顯的毒副作用，幾乎無毒性的Qu極具開發(fā)價(jià)值。

表1 各實(shí)驗(yàn)組裸鼠RTV值變化/±s

表1 各實(shí)驗(yàn)組裸鼠RTV值變化/±s

注：Qu為槲皮素；與0.9%氯化鈉溶液組比較，aP＜0.05

組別0.9%氯化鈉溶液組順鉑（5 mg/kg）Qu（50 mg/kg）Qu（25 mg/kg）Qu（12.5 mg/kg）與0.9%氯化鈉溶液組比較P值順鉑（5 mg/kg）Qu（50 mg/kg）Qu（25 mg/kg）Qu（12.5 mg/kg）鼠數(shù)6 6 6 6 6 2 d 1.58±0.59 1.27±0.40 1.09±0.16 1.12±0.34 1.00±0.07 4 d 1.85±0.62 1.59±0.62 1.30±0.29 1.41±0.41 1.15±0.27 6 d 2.85±0.74 1.98±0.87 1.71±0.61a 1.85±0.48a 1.32±0.38a 8 d 3.29±1.02 2.05±0.79a 1.58±0.55a 2.20±0.80 1.81±0.56 10 d 4.38±0.62 2.25±0.76a 1.85±0.58a 2.58±0.55a 2.29±0.52a 12 d 5.08±0.36 2.17±0.57a 2.19±0.53a 2.79±0.63a 2.41±0.53a 14 d 5.81±0.52 2.67±1.02a 2.81±0.69a 3.50±0.65a 3.05±0.82a 16 d 6.30±0.58 2.54±0.96a 2.82±0.63a 3.47±0.48a 3.67±1.29a 18 d 8.13±2.16 3.10±0.46a 3.47±0.72a 4.11±0.55a 3.61±0.82a 20 d 8.58±0.73 3.26±0.93a 4.00±0.64a 4.51±0.77a 5.12±0.82a 0.000 0.000 0.001 0.003 0.650 0.810 0.760 0.920 0.770 0.650 0.850 0.560 0.060 0.045 0.049 0.039 0.045 0.028 0.037 0.032 0.016 0.013 0.025 0.022 0.001 0.002 0.009 0.008 0.002 0.007 0.012 0.009 0.000 0.000 0.005 0.005 0.000 0.000 0.001 0.000

表2 槲皮素（Qu）對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤腫瘤瘤重的影響及抑瘤率

表3 各實(shí)驗(yàn)組裸鼠相對(duì)腫瘤增殖率［T/C（%）］

2.3 Qu對(duì)HepG2肝癌裸鼠皮下移植瘤細(xì)胞凋亡的影響采用原位末端標(biāo)記（TUNEL）的方法檢測HepG2移植瘤組織病理切片中細(xì)胞凋亡的情況，結(jié)果顯示中劑量、高劑量和順鉑組的腫瘤細(xì)胞發(fā)生了明顯的凋亡，空白對(duì)照組和低劑量組的腫瘤細(xì)胞只發(fā)生了極為少量的細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步分析HepG2細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于陽性組25.73%的凋亡率，50 mg/kg的Qu也能使其凋亡率達(dá)到20.17%（圖4），且與0.9%氯化鈉溶液組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，表4）。

圖4 不同濃度的槲皮素與順鉑對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

表4 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡統(tǒng)計(jì)值比較

3 討論

Qu是植物界中含量最豐富的黃酮類化合物之一，廣泛存在于各種蔬菜、水果以及中草藥中。Qu可通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，且由于其較高的安全性，使Qu的抗肝癌活性已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一［9-10］。本研究首先通過體外直接抑制實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Qu對(duì)HepG2細(xì)胞具有明顯的抑制活性，并且隨著檢測時(shí)間的延長，抑瘤活性增加，其IC50值由24 h的110.50μmol/L降低至72 h的46.38μmol/L，具有顯著的時(shí)間與濃度依乘效果。通過對(duì)Balb/C裸鼠（nu/nu）皮下移植瘤的抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Qu能夠濃度依賴性的抑制移植瘤的生長，其中50 mg/kg的Qu在前12 d內(nèi)其抑制活性較陽性藥物順鉑更好。在HepG2移植瘤腫瘤瘤重方面，25和50 mg/kg的Qu都能顯著減小瘤重，且50 mg/kg的Qu抑制作用與陽性藥順鉑弱相當(dāng)，但由于順鉑的毒性，導(dǎo)致給藥后期實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體質(zhì)量降低近30%，甚至導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡。同時(shí)，可能由于陽性組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本身體質(zhì)量下降嚴(yán)重，營養(yǎng)供應(yīng)不足導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長受到抑制，而表現(xiàn)出較為顯著的抑制活性。相比之下，Qu各劑量組動(dòng)物體質(zhì)量與對(duì)照組相比無明顯變化，表明其幾乎無毒性，且中、高劑量（25和50 mg/kg）的Qu還能顯著提升HepG2的凋亡。綜上所述，良好的抗腫瘤活性、極低的藥物毒性以及龐大的自然儲(chǔ)備，使得Qu極具研究開發(fā)的潛能。