微小RNA-503在急性腦梗死病人血清中的表達及對胰島素樣生長因子1受體信號通路的調控

張珊珊，蒲超，張翼，楊旭，季一飛

急性腦梗死（Acute cerebral infarction，ACI）是一種腦血管疾病：腦部血管出現狹窄甚至堵塞后，血液循環出現障礙，腦部供血、供氧中斷，致使組織壞死以及神經損傷。ACI以相應神經功能缺失為臨床表現，具有較高的發病率、高致殘率和高死亡率，不僅危害病人生命，也加重了家庭和社會的負擔［1］。目前，關于ACI研究的熱點集中在ACI的預防、降低其致殘率和死亡率。

研究表明，ACI病人和動物模型中的血清微小RNA（miRNA）表達譜發生了顯著改變，且miRNA被證實可參與作用腫瘤細胞增殖和耐藥。其中miRNA-503作為抑癌基因在腫瘤發生發展中起重要作用［2］。胰島素樣生長因子1受體（Insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）是一種跨膜受體，屬于酪氨酸激酶受體大家族，可被IGF-1和IGF-2等激活，常在結直腸癌、胃癌等腫瘤中過表達，促進腫瘤轉化、發展，并抑制癌細胞凋亡［3］。miRNA-503可通過調控IGF-1R的表達進而抑制肝癌細胞增殖，促進凋亡［4］。

腦梗死的發生可能與惡性腫瘤有關，被稱為惡性腫瘤相關腦梗死［5］。為研究miRNA-503在ACI病人體內與腫瘤的關系，本文檢測了ACI病人血清中miRNA-503的表達水平，并初步分析了其在膠質瘤細胞U87中對于IGF-1R表達及調控PI3K/Akt信號通路的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料選取2017年9月至2019年4月間于南充市中心醫院確診的92例急性腦梗死病人作為觀察組，其中男性57例，女性35例；年齡范圍為55～72歲，年齡（66.33±2.26）歲；體質量范圍為52～61 kg，體質量（56.83±2.87）kg。病人均無其他嚴重并發癥。同時挑選同期間于我院體檢健康者92例作為對照組，其中男性55例，女性37例；年齡范圍為52～70歲，平均（64.63±2.77）歲；體質量范圍為51～63 kg，體質量（57.44±2.96）kg。兩組一般資料比較，均差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。所有病人及其家屬均知情并簽署同意書。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 納入標準和排除標準納入標準：所有病人的診斷均符合中國腦梗死中西醫結合診治指南（2017）［6］的相關診斷標準，并經過腦血管造影和CT檢查確診［7］。

排除標準：患有嚴重原發性疾病者，如肝腎疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、腫瘤、嚴重感染等；有腦梗死病史者；最近3個月內受嚴重外傷者；近期接收過重大手術者。

1.3 樣本采集及處理對照組于體檢當日清晨空腹抽取肘靜脈血5 mL。觀察組于入院第2天、禁食10～12 h后清晨空腹抽取肘靜脈血5 mL。室溫放置2 h或4℃過夜后于1 000g離心20 min，分離血清標本，密封保存置于-20℃冰箱或者-80℃冰箱保存，避免反復凍融。

1.4 血清中miRNA-503及IGF-1R的表達水平分析取觀察組和對照組血清樣品，提取所有樣本RNA后，使用全式金公司的TransScript Two-Step RTPCR SuperMix（AT401-01）試劑盒進行反轉錄，獲得cDNA。

根據GeneBank中miRNA-503的序列（NR_030228.1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成miRNA-503引物，F：5′-TGCCCTAGCAGCGGGAA-3′，R：5′-TACCCTGGCAGCGGAAACA-3′。選用U6基因作為內參，F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。將上述cDNA作為模板，按照以下程序在Real-Time PCR儀（ABI 7500，USA）上進行qPCR擴增：95℃，5 min；95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；40個循環。采用2-ΔΔCt的方法計算miRNA-503的相對表達量。

取對照組和觀察組血清樣本，按照人IGF-1R檢測試劑盒（96T/48T，上海紀寧酶聯科技有限公司）的操作說明，對兩組血清樣本中的IGF-1R表達水平進行檢測。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡以將U87細胞miRNA-503模擬組細胞和miRNA-503對照組細胞以7×103個/孔的密度接種于96孔板中，加入含有10%胎牛血清的高糖DMEM細胞培養液100μL，置于37℃，5%CO2培養箱中培養。培養24 h后，將miRNA-503模擬物以及對照物分別轉染細胞中，繼續培養48 h，收集細胞，流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況。重復3次實驗。

1.6 Western blot檢測U87細胞置于加入含有10%胎牛血清的高糖DMEM細胞培養液中，置于37℃，5%CO2培養箱中培養。各組細胞以3.0×105個/孔的密度接種12孔板，培養24 h后，收集細胞，進行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳：濃縮膠恒壓80 V，20 min；分離膠恒壓120 V，電泳至溴酚藍到凝膠底部。使用Bio-Rad半干轉印槽（Trans-Blot SD，170-3940）在恒壓15 V，30 min條件下轉印至PVDV膜（生工，F019532-0010）。取下PVDF膜放入封閉液（TBST，5%脫脂奶粉，pH7.4）中室溫孵育2 h；使用abcam公司生產的IGF-1R一抗稀釋液（ab39398，1∶5 000），Bax一抗稀釋液（ab32503，1：5 000），p-Akt一抗稀釋液（ab38449，1∶5 000），Bcl-xl一抗稀釋液（ab32370，1∶5 000），c-Myc一抗稀釋液（ab32072，1∶5 000），p-STAT3一抗稀釋液（EP2147Y，1∶5 000）室溫孵育PVDF膜1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；使用全式金公司生產的HRP標記的二抗羊抗兔IgG稀釋液（HS101-01，1∶10 000）室溫孵育PVDF膜1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；最后根據ECL化學發光液（180-501，上海天能）使用說明，將PVDF膜置于Bio-Rad凝膠成像系統中顯影。實驗重復3次。

1.7 統計學方法采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計學分析，計量資料以±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本均數的t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。當P＜0.05時認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清樣本中miRNA-503及IGF-1R的表達量比較觀察組miRNA-503表達量顯著低于對照組，而IGF-1R的檢測量則顯著高于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 急性腦梗死和健康對照血清中miRNA-503及IGF-1R的表達量

2.2 miRNA-503及IGF-1R在HEB細胞和U87細胞中的表達量比較miRNA-503在HEB細胞中的表達顯著高于U87細胞（P＜0.05）；IGF-1R在HEB細胞中的表達顯著低于U87細胞（P＜0.05）。見圖1，表2。

圖1 IGF-1R在腦正常膠質細胞（HEB）及膠質瘤細胞U87中的表達

表2 miRNA-503及IGF-1R在腦正常膠質細胞（HEB）及膠質瘤細胞U87中的表達量

2.3 miRNA-503在不同處理的U87細胞中的表達量比較3組細胞中miRNA-503的相對表達量差異有統計學意義（P＜0.05）。其中，miRNA-503在空白對照組和陰性對照組的相對表達量差異無統計學意義（P＞0.05）；與兩對照組相比，模擬組細胞中的miRNA-503的相對表達量顯著增高（P＜0.05）。見表3。

表3 miRNA-503不同處理的膠質瘤細胞U87中的表達量

2.4 不同處理的U87細胞的凋亡情況比較3組細胞凋亡率差異有統計學意義（P＜0.05）。其中，空白對照組和陰性對照組的凋亡率差異無統計學意義（P＞0.05）；與兩對照組相比，模擬組細胞凋亡率顯著增高（P＜0.05）。見圖2，表4。

2.5 IGF-1R信號通路相關蛋白在不同處理的U87細胞中表達情況比較3組細胞中的各種蛋白表達差異有統計學意義（P＜0.05）。空白對照組和陰性對照組差異無統計學意義（P＜0.05）。與空白對照組相比，IGF-1R、p-Akt、p-STAT3及Bcl-xL等蛋白表達量顯著下降（P＜0.05）；而c-Myc和Bax的表達量則顯著升高（P＜0.05）。見圖3，表5。

圖2 三組膠質瘤細胞U87的凋亡情況

表4 不同處理的膠質瘤細胞U87組中細胞的凋亡情況

3 討論

ACI的發病機制相當復雜，涉及多種機制。臨床檢測表明，患有不同疾病的病人的血漿miRNA表達不同［8］。多種miRNA在ACI病人血清中存在明顯差異，并發揮重要功能［9-11］。miRNA屬于非編碼RNA，通常由18～25個核苷酸組成，可在轉錄后調節相關基因的表達。一般可通過降解靶基因mRNA或者抑制蛋白翻譯等手段對靶基因進行負調節［12］。目前研究已證實，miRNA可參與細胞發育、分化、生長、增殖以及凋亡等各種生理過程，并且能夠參與調節炎性細胞和介質的表達［13-14］。本研究發現，與健康人相比，ACI病人血清中miRNA-503表達水平顯著降低，而IGF-1R水平則顯著升高。這表明，miRNA-503及IGF-1R極可能參與了ACI的發病過程。

圖3 IGF-1R信號通路相關蛋白在不同處理的膠質瘤細胞U87中表達

表5 IGF-1R信號通路相關蛋白在不同處理的膠質瘤細胞U87中表達/±s

表5 IGF-1R信號通路相關蛋白在不同處理的膠質瘤細胞U87中表達/±s

組別空白對照組陰性對照組miRNA-503模擬組F值P值t值（空白對照組比陰性對照組）P值（空白對照組比陰性對照組）t值（空白對照組比miRNA-503模擬組）P值（空白對照組比miRNA-503模擬組）t值（陰性對照組比miRNA-503模擬組）P值（陰性對照組比miRNA-503模擬組）樣本數5 5 5 IGF-1R 0.93±0.09 0.90±0.10 0.49±0.05 44.000＜0.001 0.499 0.632 9.556＜0.001 8.2000＜0.001 p-Akt 0.76±0.07 0.81±0.09 0.43±0.05 41.260＜0.001 0.981 0.356 8.578＜0.001 8.253＜0.001 c-Myc 0.51±0.06 0.52±0.05 1.07±0.11 84.640＜0.001 0.286 0.782 9.994＜0.001 10.180＜0.001 p-PI3K 1.06±0.09 0.99±0.10 0.30±0.04 134.300＜0.001 1.163 0.278 17.250＜0.001 14.330＜0.001 Bcl-xL 1.12±0.10 1.11±0.10 0.52±0.07 71.100＜0.001 0.158 0.878 10.990＜0.001 10.810＜0.001 Bax 0.44±0.05 0.45±0.04 1.09±0.11 128.400＜0.001 0.349 0.736 12.030＜0.001 12.230＜0.001

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路的激活和相關免疫功能調控都與miRNA密切相關［15-16］。研究表明，多種miRNA都可參與該通路的調節［17-18］，且都有IGF-1R的參與［19-21］。IGF-1R是細胞增殖、分裂以及分化中的重要調節因子，能夠預防各種細胞的凋亡損傷、誘導血管內皮生長因子的表達等［22］，其高表達與多種惡性腫瘤的發生發展明顯相關［23］。現有的研究表明，miRNA-503參與了多種腫瘤細胞的生長調節過程［24］，且都靶向IGF-1R發揮功能［2，4］。

為研究miRNA-503在ACI相關腫瘤疾病中對IGF-1R及其信號通路中的作用，本研究以人腦正常膠質細胞HEB細胞及膠質瘤U87細胞為研究對象，進行了初步探討。結果發現，與HEB細胞相比，U87細胞中miRNA-503表達水平顯著降低，而IGF-1R水平則顯著升高。進一步證實了miRNA-503及IGF-1R在腫瘤細胞發展中起著重要作用。在U87細胞中過表達miRNA-503以后，細胞凋亡率增加，細胞增殖受到明顯抑制。有文獻報道，IGF-1R活化后，可以激活PI3K、Akt等信號分子，進而增強細胞的增殖和遷移能力［22］，Bcl-xl和Bax的表達變化與細胞凋亡密切相關［25］。本實驗中Western blot結果顯示，PI3K/Akt信號通路中關鍵蛋白p-Akt、Bcl-xl和p-PI3K顯著降低，與IGF-1R表達降低一致；而c-Myc和Bax顯著升高，與細胞凋亡率增加一致。結果表明，miRNA-503表達水平升高，可抑制IGF-1R的表達，進而阻礙了PI3K/Akt信號通路的激活，同時Bcl-xl/Bax比例下降，共同致使癌細胞增殖減慢，凋亡增加。

本文尚且存在不足之處：（1）本文僅在細胞學水平對miRNA-503對IGF-1R的生物學功能進行了初步探討，并代替體內真實狀況，需要相關的動物模型，進一步驗證本文的結論。（2）CAI的發病機制比較復雜，miRNA-503影響的信號通路可能是多方向的，活血也有其他miRNA分子的參與，因此在今后的研究中需要驗證其他信號通路的激活及miRNA分子表達。

綜上所述，在急性腦梗死病人血清中，miRNA-503呈現高水平表達，而IGF-1R則呈現低水平表達。miRNA-503在U87細胞中的過表達能夠抑制細胞增殖，可能是通過抑制IGF-1R表達，進而調節PI3K/Akt通路中相關蛋白表達，從而抑制了U87的增殖。