膿毒癥病人血清肌腱蛋白C的臨床意義和預后

孫芳園，許開亮，袁林，孫晶晶，韓耀國，雷鳴，張濤

膿毒癥是機體對感染的反應失調而導致危及生命的器官功能障礙，具有較高的死亡風險［1］。膿毒癥常常同時存在炎癥反應和代償性抗炎反應［2］。同時，促炎癥反應和抗炎癥反應之間的復雜相互作用決定膿毒癥的結果［3］。因此，膿毒癥早期診斷和預后預測需要新的生物標志物［4］。

肌腱蛋白（Tenascins）是一種細胞外基質糖蛋白，參與多種病理過程如炎癥、組織損傷、腫瘤血管生成和轉移［5］。Tenascin-C的持續高表達常見于炎癥、組織重塑和自身免疫性疾?。?］。感染和損傷能誘導Tenascin-C表達，促使機體對細菌脂多糖（LPS）產生有效的免疫應答。在小鼠膿毒癥模型中，LPS處理能增強巨噬細胞表達Tenascin-C，并與LPS所誘導的促炎癥細胞因子有關［7］。這表明Tenascin-C可能是一種膿毒癥的炎癥促進因子。然而，血清Tenascin-C在膿毒癥病人的表達和臨床意義尚不清楚。

在這項研究中，我們作了一個初步的臨床研究，探討膿毒癥病人血清Tenascin-C濃度和臨床嚴重程度、病死率與炎癥反應的相關性。我們的研究將提供血清Tenascin-C水平為膿毒癥病人的預后標志物。

1 資料與方法

1.1 病例設計選取2016年1月至2017年6月上海中醫藥大學附屬第七人民醫院普通內科重癥監護室（ICU）收治的膿毒癥病人174例，根據ACCP/SCCM共識會議［8］提出的診斷標準確診。膿毒癥被定義為存在微生物學證實的感染、急性器官衰竭和全身炎癥反應綜合征（至少兩個以下參數：①溫度＞38或＜36 ?C；②心率＞90次/分；③呼吸頻率＞20次/分或PaCO2＜32 mmHg；④血白細胞（WBC）計數＞12 000或＜4 000細胞/mm3，或＞10%不成熟的形式）。感染性休克是膿毒癥合并頑固性低血壓（收縮壓＜90 mmHg），需要補液和升壓藥維持血壓。應用膿毒癥相關器官衰竭評估（Sepsis-related Organ Failure Assessment，SOFA）評分來定量估計病人器官損害嚴重程度。對這些病人實施了標準的膿毒癥治療，包括抗生素、機械通氣和液體復蘇。所有病人進行監測，直到他們從ICU出院或死亡，進一步的隨訪至少30 d。同時選取80名性別和年齡相匹配的健康獻血者為健康對照組。本研究經醫院倫理委員會批準，并按照《赫爾辛基宣言》進行。病人或家屬簽署知情同意書。

1.2 數據測量記錄所有病人的連續變量：年齡、SOFA評分、ICU天數、血清肌酐、乳酸、白細胞計數和血小板。所有實驗室數據為病人入院24 h內抽血測得。記錄所有病人的分類變量：性別、感染部位、呼吸機應用，感染性休克。終點為30 d存活。抽取入住ICU24 h內的靜脈血液樣本，4°C離心5 000g×5 min，-80 °C 存儲。酶聯免疫吸附法（ELISA）測定血清C反應蛋白（CRP）、白細胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平。

1.3 ELISA檢測血清可溶性Tenascin-C按照商業化試劑盒（Fujioka，日本）的指示測量健康對照組和膿毒癥病人血清Tenascin-C水平［9］，用酶標儀測量在450 nm吸光度。根據不同濃度重組人Tenascin-C建立的標準曲線，確定個病例的血清Tenascin-C濃度。

1.4 統計學方法應用SPSS 19.0統計軟件分析數據。連續變量以中位數（四分位數）表示，用Mann-Whitney U秩和檢驗進行兩獨立樣本的非參數檢驗。分類變量以頻率（百分比）表示，用χ2檢驗。Tenascin-C與連續變量之間的相關性用等級相關檢驗（Spearman’s rank correlation test）分析。用Logistic多因素回歸模型分析Tenascin-C對病人30 d病死率的獨立貢獻，以比值比（odds ratio）和95%置信區間（CI）表示。制作ROC曲線確定血清Tenascin-C對于存活者和死亡者之間的區分點。制作Kaplan-Meier曲線分析高血清Tenascin-C水平（≥56.9 ng/L）對膿毒癥病人30 d病死率的影響。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究人群在ICU連續性收治的174例膿毒癥病人中，男性112例，女性62例，中位年齡60歲。隨訪30 d后，死亡60例，病死率34.5%。與存活者相比，死亡組病人具有明顯增高的SOFA評分、血清肌酐、乳酸、CRP、IL-6和TNF-α水平（均P＜0.05）。同時，死亡組的感染性休克和呼吸機使用發生頻率較高（均P＜0.05）。ICU入院時膿毒癥病人的臨床特征見表1。

表1 膿毒癥病人174例臨床特征

2.2 血清Tenascin-C升高與膿毒癥病情嚴重程度的相關性分析膿毒癥病人血清Tenascin-C水平（中位數為57.1 ng/L）明顯高于健康對照（中位數為24.1 ng/L）（P＜0.001）（圖1A）。在膿毒癥病人中，死亡組血清Tenascin-C水平（中位數為64.9 ng/L）明顯高于存活組（中位數為52.1 ng/L）（P＜0.001）（圖1B）。血清Tenascin-C在使用與不使用呼吸機病人之間差異無統計學意義（圖1C）。休克病人血清Tenascin-C明顯高于無休克者（圖1D）。

2.3 血清Tenascin-C和臨床變量之間的相關性我們采用Spearman等級相關檢驗分析了血清Tenascin-C與連續變量的相關性。所有膿毒癥病人血清Tenascin-C與SOFA評分、血清肌酐、CRP、IL-6和TNF-α之間正相關（均P＜0.05）（表2）。

表2 膿毒癥病人血清Tenascin-C與其它定量指標的相關性

圖1 膿毒癥病人和健康對照組的血清Tenascin-C的水平：A為膿毒癥病人（n＝174）血清Tenascin-C水平高于健康對照組（n＝80）（P＜0.001）；B為死亡組（n＝60）血清Tenascin-C水平高于存活組（n＝114）；C為使用呼吸機病人（n＝90）血清Tenascin-C水平和不使用呼吸機病人（n＝84）差異無統計學意義；D為休克者（n＝97）血清Tenascin-C水平高于無休克者（n＝77）

2.4 高血清Tenascin-C對膿毒癥病人預后的影響采用Logistic多因素回歸模型探討Tenascin-C對膿毒癥病人預后的獨立貢獻。結果表明，血清Tenascin-C水平、SOFA評分和休克與30 d病死率之間相關（表3）。ROC分析確定30 d病死率血清Tenascin-C閾值。曲線下面積（AUC）是0.717（95%CI＝0.640-0.795；P＜0.001）（圖2A）。血清Tenascin-C的水平診斷界值為56.9 ng/L（敏感性為75%，特異性

表3 Logistic多因素回歸預測膿毒癥174例30 d病死率

為61.4%）。進一步應用Kaplan-Meier曲線分析高血清Tenascin-C對膿毒癥病人預后的影響。與低血清Tenascin-C病人（＜56.9 ng/L）相比，高血清Tenascin-C病人（≥56.9 ng/L）表現出30 d病死率增高，差異有統計學意義（Log Rank卡方值＝23.19，P＜0.001）（圖2B）。

3 討論

在這項研究中，我們測量了174例膿毒癥病人和80名健康對照血清的Tenascin-C水平，與健康對照組相比，膿毒癥病人血清Tenascin-C明顯升高。在膿毒癥病人中，血清Tenascin-C水平在死亡組高于存活組、休克組高于非休克組。進一步分析顯示，血清Tenascin-C水平與膿毒癥臨床嚴重程度和炎癥介質相關，并且是獨立預后因素。血清Tenascin-C水平≥56.9 ng/L的膿毒癥病人，在30 d內有更高的病死率。

Tenascin-C是一種細胞外基質蛋白，在大多數成年健康組織不表達，而在感染組織高水平表達［9］。我們觀察到膿毒癥病人血清Tenascin-C水平高于健康對照，說明Tenascin-C可能是膿毒癥的一種血清分子標志。在LPS誘導的膿毒癥小鼠，巨噬細胞表達的Tenascin-C增強；而用CO處理抑制膿毒癥小鼠炎癥反應的同時，也降低了LPS誘導的Tenascin-C表達。這表明Tenascin-C可能參與了膿毒癥的發病機制，成為一個潛在的治療靶點。

圖2 高血清Tenascin-C對膿毒癥病人預后的影響：A為ROC曲線用來確定區分存活組和死亡組的血清Tenascin-C的分界點；B為Kaplan-Meier生存曲線顯示相比于低血清Tenascin-C病人（＜56.9 ng/L），高血清Tenascin-C病人（≥56.9 ng/L）30 d病死率升高

我們還發現血清Tenascin-C水平與膿毒癥的幾個指標，SOFA評分和血清肌酐呈正相關。SOFA評分用來估計膿毒癥癥狀嚴重程度和多器官衰竭［10］，而血清肌酐反映了膿毒癥病人腎臟功能［11］。血清Tenascin-C還與膿毒癥病人的預后相關：血清Tenascin-C水平是膿毒癥病人的一個獨立預后因素，Tenascin-C≥56.9 ng/L的病人30 d病死率升高。目前，ICU膿毒癥病人的一個主要挑戰是快速早期診斷和干預。因此，尋找新的生物標志物是實現這一目標并施行個體化治療和改善膿毒癥預后的關鍵［12］。我們的研究表明，作為具有多種生物學功能的蛋白，Tenascin-C可能通過眾多未知的機制參與膿毒癥的發病。

Tenascin-C是一個廣泛的炎癥誘導物。血清高水平Tenascin-C見于許多炎癥性疾病，如急性腦梗死［13］、膠原病［14］、類風濕心肌炎［15］和系統性紅斑狼瘡［16］。在急性炎性關節炎和膝骨關節炎，升高的Tenascin-C能促進炎癥因子表達和軟骨基質降解，既是關節損傷的標志物，又是關節破壞的促進物［17］。我們的研究顯示膿毒癥病人血清Tenascin-C水平與血清炎癥因子，CRP、IL-6和TNF-α呈正相關。經LPS誘導后巨噬細胞高表達Tenascin-C，后者增強巨噬細胞合成與分泌促炎細胞因子，從而促進LPS誘導后Toll樣受體4（TLR4）的炎癥反應［18］。Tenascin-C是TLR4炎癥軸的廣泛調控因子。如在心肌成纖維細胞，Tenascin-C通過激活TLR4上調IL-6的表達［19］。Tenascin-C與炎癥因子似乎存在著相互調控網絡，如TNF-α可以促進肝癌細胞表達Tenascin-C，并促進癌細胞轉移［20］。這種自反饋環路可以解釋Tenascin-C在急性炎癥中短暫高表達，而在慢性炎癥和癌癥中持續高表達［21］。

本研究的局限性如下。首先，這是在一家醫院進行研究的初步結果，需要通過多中心研究來進一步證實。其次，Tenascin-C在急性炎癥中短暫高表達后恢復正常，而本研究只測量了膿毒癥病人入院初的血清Tenascin-C水平，入院后血清Tenascin-C的時間序列表達以及與預后的關系還需進一步研究。再次，血清Tenascin-C的來源還沒有確定，下一步實驗需要測量病人外周血單核細胞以及實驗動物組織巨噬細胞Tenascin-C的表達。

總之，本研究表明，膿毒癥病人血清Tenascin-C濃度升高。血清Tenascin-C的水平與臨床嚴重程度、全身炎癥反應和30 d病死率相關。我們的研究結果提示Tenascin-C可能參與了膿毒癥的發病機制，并作為一個潛在的生物標志物和治療靶點。