CYP2C19基因多態性與缺血性腦卒中發病及預后的相關性

嚴駿 翁方中 戴偉 周瑞祥 胡朝梁

(武漢市第一醫院重癥醫學科，湖北 武漢 430022)

缺血性腦卒中(ISS)是一組以腦組織缺血性損傷為主要臨床表現的急性腦血管疾病，具有發病率高、致殘率高、死亡率高及復發率高的特點。據統計，我國每年約有200萬新發腦卒中病例，其中ISS占70%～80%〔1〕。ISS的發病受飲食、環境、遺傳等多種因素交互影響近年對ISS遺傳易感基因的研究成為熱點。細胞色素P450 藥物代謝酶(CYP)2C19活性存在較大的種族及個體差異，這種差異主要由遺傳多態性導致。G681A、G636A是CYP2C19基因的主要突變體，有研究發現，CYP2C19 G681A、G636A單核苷酸多態性可增加心血管事件的發生率，并與心血管不良預后相關〔2〕，但其與ISS發生的關系目前少有報道。抗血小板聚集是ISS治療的主要手段，國內外腦卒中防治指南中均將阿司匹林和(或)氯吡格雷推薦為ISS的一、二級防治藥物。但是阿司匹林與氯吡格雷對于血小板活性的抑制作用存在較大的個體差異。有研究報道，分別有15%～48%、17%～39%的ISS患者存在阿司匹林與氯吡格雷抵抗現象〔3〕。抗血小板聚集藥物的代謝受CYP2C19活性的影響。有研究發現，CYP2C19基因多態性導致不同人群及個體對抗血小板藥物的代謝能力不同，進而出現不同的治療效果〔4〕。本研究檢測120例老年ISS患者與120例健康體檢者CYP2C19基因表達情況，分析CYP2C19基因多態性與ISS發生、抗血小板藥物代謝及預后的相關性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 將2014年1月至2016年6月本武漢市第一醫收治的老年ISS患者120例作為ISS組，男69例，女51例；年齡60～76〔平均(64.56±3.21)〕歲。納入標準：①符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》中ISS診斷標準〔5〕，并經頭顱計算機斷層掃描(CT)或磁共振成像(MRI)檢查確診；②首次發病，且發病時間在12 h內入院；③年齡>60歲。排除標準：①凝血功能障礙，血小板計數<100×109/L或>450×109/L；②腦腫瘤、腦出血、顱內感染、腦梗死后合并出血、短暫性腦缺血發作；③嚴重心、肝、腎疾病，惡性腫瘤、免疫系統疾病；④近2 w內使用其他抗血小板聚集藥物、抗凝藥物、溶栓類藥物或其他非甾體類抗炎藥、質子泵抑制劑者；④對本研究所使用藥物過敏者。另選取同期健康體檢者120例作為對照組，男70例，女50例；年齡60～78〔平均(65.02±4.02)〕歲，兩組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準通過，患者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑與儀器 人血細胞基因組DNA提取試劑盒、2倍Taq預混液10 μl為上海百奧生物科技公司生產，限制性內切酶SmaⅠ、BamHI為北京紐英倫生物技術有限公司生產，瓊脂糖為上海博亞生物技術有限公司生產。Roche LightCycler?480Ⅱ實時熒光定量PCR擴增儀為美國Roche公司生產，Bio-Rad Power PAC300電泳儀為美國Bio-Rad公司生產，UVPGDS-8000凝膠成像分析儀為美國UVP公司生產。

1.3治療方法 ISS組患者入組后均依據《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》對癥治療，并給予氯吡格雷〔賽諾菲(杭州)制藥有限公司生產，國藥準字J20080090，規格：75 mg/片，7片/盒〕75 mg/d口服，持續治療12個月。

1.4觀察指標

1.4.1基線資料 收集ISS組人口學特征(性別、年齡、體重指數、吸煙史、飲酒史等)，既往史(高血壓、糖尿病、心肌梗死、高脂血癥等)，腦卒中TOAST分型(大動脈粥樣硬化型、心源性腦栓塞型、小動脈閉塞型、其他)，藥物治療(降壓藥、降糖藥、他汀類藥物、其他抗血小板聚集藥物)，入院時治療美國國立衛生研究院腦卒中量表(NIHSS)評分。

1.4.2血小板聚集抑制率檢測 ISS組治療第7天采集空腹靜脈血4 ml，分別裝于肝素抗凝管和檸檬酸抗凝管，2 h內采用TEG5000血栓彈力圖儀(美國Haemoscope公司生產)檢測二磷酸腺苷誘導的血小板聚集抑制率。血小板聚集抑制率>40%為氯吡格雷敏感，≤40%為氯吡格雷抵抗。

1.4.3預后 治療6個月后采用改良Rankin量表(mRS)〔6〕評價神經功能恢復情況，mRS評分0～6分，0分為完全沒有癥狀，6分為死亡。mRS≤2分為預后良好，mRS≥3分為預后不良。

1.4.4CYP2C19基因型檢測 采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性法(PCR-RFLP)進行CYP2C19基因型檢測。受試者采集肘正中靜脈血2 ml，置于EDTA真空抗凝管中，-20℃保存，待測。按照人血細胞基因組DNA提取試劑盒說明提取DNA。根據美國Sequenom公司報道的序列合成CYP2C19基因引物，基因型為G681A、G636A，由華大基因公司合成，引物序列見表1。PCR擴增反應體系(25 μl)：2倍預混合液10 μl，上、下游引物各0.5 μl，DNA模板3 μl，蒸餾水6 μl，Taq酶0.25 μl。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s；60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環35次，72℃ 終末延伸10 min。取PCR擴增產物5 μl進行SmaⅠ、BamHI限制性內切酶酶切后，進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀下觀察結果，主要檢測基因分型為野生型(GG)、突變雜合型(AG)和突變純合型(AA)，攜帶野生型(GG)基因者為快代謝型，突變雜合型(AG)為中間代謝型，突變純合型(AA)為慢代謝型。PCR產物送華大基因公司合成進行雙向測序，測序結果與美國Sequenom公司的序列進行對比分析。

表1 CYP2C19基因 G681A型、G636A型引物序列

1.5統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t、χ2或Fisher確切概率法檢驗，各基因型頻率進行Hardy-Weinberg平衡驗證，對預后的影響因素進行非條件多元Logistic回歸分析。

2 結 果

2.1Hardy-Weinberg平衡定律檢驗 CYP2C19 G681A和G636A在ISS組(χ2=1.380、1.290，P=0.240、0.256)、對照組(χ2=0.265、0.405，P=0.607、0.525)中的分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律，具有群體代表性，見表2。

表2 ISS組與對照組CYP2C19 基因分布〔n(%),n=120〕

2.2CYP2C19基因多態性分析 CYP2C19 G681A的PCR產物長度192 bp，CYP2C19 G636A的PCR產物長度為234 bp。 CYP2C19 G681A經SmaⅠ酶切后，GG型2條帶(111 bp、81 bp)，AG型3條帶(192 bp、111 bp、81 bp)，AA型1條帶(192 bp)，見圖1。CYP2C19 G636A經BamHI酶切后，GG型2條帶(135 bp、99 bp)，AG型3條帶(234 bp、135 bp、99 bp)，AA型1條帶(234 bp)，見圖2。

M:DL 2000 Marker；2：AA，5、6：GG，1、3、4：AG圖1 PCR-SmaⅠ酶切的CYP2C19基因G681A位點基因分型

M:DL 2000 Marker；1、3、4、7：AG，2：AA，5、6、8：GG圖2 PCR-BamHI酶切的CYP2C19 G636A位點基因分型

2.3CYP2C19 G681A和G636A位點基因分型頻數分布 ISS組CYP2C19 G681A位點AA型基因、G636A位點AA型、AG型基因頻率顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.4CYP2C19基因多態性與氯吡格雷抵抗的相關性 ISS組中檢出氯吡格雷敏感82例，氯吡格雷抵抗38例。氯吡格雷抵抗組CYP2C19 基因G681A位點AG型、AA型頻率顯著高于敏感組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

2.5影響預后的單因素分析 ISS組經治療后預后良好79例，預后不良41例，預后不良組吸煙、高血壓、糖尿病、氯吡格雷抵抗比例及CYP2C19 基因G681A位點AG型、AA型頻率顯著高于預后良好組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

2.6影響預后的多因素Logistic回歸分析 將預后不良作為因變量，上述單因素分析有統計學意義的指標為自變量，進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示糖尿病、氯吡格雷抵抗、攜帶CYP2C19 基因G681A位點AA型是不良預后發生的獨立危險因素，見表5。

表3 CYP2C19 基因多態性與氯吡格雷抵抗的相關性〔n(%)〕

表4 預后良好組與預后不良組一般資料比較

表5 不良預后的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

CYP2C19是CYP450家族中重要的藥物代謝酶，參與臨床2%左右的藥物代謝〔7〕。目前已有研究表明，CYP2C19 GG型與冠心病、冠脈綜合征等的發生有關〔8，9〕。Bykov等〔10〕研究發現，CYP2C19 G636A 位點AG型基因使動脈粥樣硬化的風險增加3.8倍。Daniel〔11〕對急性冠脈綜合征患者的研究發現，攜帶CYP2C19 AA、AG型基因的患者發生腦卒中的風險較未攜帶者明顯增加。本研究提示CYP2C19 G681A位點AA型基因、CYP2C19 G636A位點AA型和AG型基因與ISS的發病有關，推測CYP2C19 A等位基因可能與腦動脈粥樣硬化形成有關，進而引發ISS，但其具體機制有待研究。

CYP2C19在抗血小板聚集藥物的代謝中發揮重要作用。阿司匹林、氯吡格雷等作為前體藥物，需經CYP2C19酶代謝為活性產物方能發揮抗血小板聚集作用。近年研究發現，心腦血管疾病患者服用阿司匹林、氯吡格雷后出現藥物抵抗現象存在較大的個體差異，這可能與CYP2C19基因多態性有關〔12，13〕。劉志勤等〔14〕研究報道，攜帶CYP2C19 AA型、AG型、GG型基因的腦卒中患者在服用氯吡格雷后血小板聚集抑制率分別為(67.5±21.6)%、(57.6±23.4)%、(31.4±15.1)%，攜帶CYP2C19 AA型、AG型基因是氯吡格雷抵抗的獨立危險因素。Rosafio等〔15〕研究也得到相似結論，攜帶CYP2C19 G681A 和G636A位點A等位基因的患者口服氯吡格雷后起效時間較攜帶G等位基因的患者慢，達到峰值的時間為24～48 h，而攜帶G等位基因的峰值短于24 h。本研究證實攜帶CYP2C19 G681A位點AG型、AA型基因與氯吡格雷抵抗有關。但氯吡格雷抵抗與CYP2C19 G636A基因無明顯相關性，這與Cavallari等〔16〕報道相符。Cavallari等〔16〕研究發現，腦卒中患者攜帶CYP2C19 G681A位點A等位基因與二磷酸腺苷誘導的血小板聚集呈正相關，而患者CYP2C19 G636A基因與二磷酸腺苷誘導的血小板聚集無明顯相關性。

目前關于CYP2C19基因多態性對ISS預后的影響研究主要集中在CYP2C19基因對氯吡格雷抵抗的影響上。馮芹等〔17〕研究報道，攜帶有CYP2C19慢代謝型功能缺失等位基因(AA、AG)的患者更易發生氯吡格雷抵抗，進而導致抗血小板聚集治療失敗，是臨床治療不良預后的獨立危險因素。郭朝群等〔18〕研究報道，攜帶有CYP2C19慢代謝型功能缺失等位基因(AA、AG)是患者不良預后及終點事件發生的獨立危險因素。本研究結果顯示氯吡格雷抵抗、攜帶CYP2C19 G681A位點AA型基因是不良預后發生的獨立危險因素，與上述報道相符。此外，本研究顯示糖尿病也是ISS患者不良預后發生的獨立危險因素。Ferlini等〔19〕研究發現，糖尿病患者體內發生的血管內皮損傷、氧化應激等可導致血小板活性增強，進而影響氯吡格雷的藥效，增加臨床不良終點事件發生的風險。由此提示，對于伴有糖尿病的ISS患者應積極控制血糖或調整氯吡格雷治療方案，減少糖尿病對預后的影響。

綜上所述，CYP2C19 G681A位點AA型基因及 G636A位點AA型、AG型基因是ISS發病的易感基因，而CYP2C19 G681A位點AG型、AA型基因與氯吡格雷抵抗密切相關。此外，G681A位點AA型基因是ISS不良預后的獨立危險因素，臨床應加強對ISS患者CYP2C19 基因多態性的檢測，對于攜帶A等位基因的患者，及早給予藥物干預或調整抗血小板藥物治療方案，改善患者預后。