miR-424在乳腺癌中的表達及與臨床病理特征之間的關(guān)系

李自濤 馬志軍 劉震 沈國雙

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科二，青海 西寧 810001)

雖然，乳腺癌患者經(jīng)過手術(shù)、化療、放療及內(nèi)分泌治療，總體的5年生存率有了明顯提高，但是每年的死亡人數(shù)仍然很龐大，給廣大女性的健康造成嚴(yán)重威脅，仍需要尋找新的治療的手段，探索新的治療靶點〔1〕。miRNAs是一類18～22個核苷酸的小非編碼RNAs片段，在疾病的發(fā)生中起重要作用，與細(xì)胞的增殖、凋亡和分化等密切有關(guān)〔2〕。miR-424屬于miR-16家族〔3，4〕，是一個由22個堿基組成的小核酸分子，可能位于X性染色體上。miR-424在很多腫瘤中都有研究〔3～14〕，包括非小細(xì)胞肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、食管癌、骨肉瘤、肝癌等。但是，在乳腺癌中研究的相關(guān)報道較少〔4〕。本研究擬通過分析85例乳腺癌患者miR-424的表達水平，觀察miR-424在癌組織中的表達情況，并分析其與乳腺癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1臨床資料 收集2016～2017年青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科行手術(shù)治療的85例早期乳腺癌患者癌組織及癌旁組織(距離癌組織大于5 cm)新鮮手術(shù)標(biāo)本，癌旁組織作為陰性對照。全部為女性，主要長期居住地在西寧市(44例，51.76%)，湟中縣(8例，9.41%)，樂都縣(8例，9.41%)，大通縣(6例，7.06%)，這幾個地區(qū)平均海拔約為2 200 m，屬于高海拔地區(qū)。居住在其他地區(qū)19例。年齡29～73歲，平均年齡(50.85±8.93)歲。其中漢族68例(80.00%)，回族8例(9.41%)，藏族6例(7.06%)，蒙古族1例(1.18%)和土族2例(2.35%)。有腫瘤家族史患者2例(2.35%)，1例為母親患有乳腺癌，另外1例為父親結(jié)腸癌患者，其余患者否認(rèn)腫瘤家族史。收集的新鮮組織迅速轉(zhuǎn)移至-80℃的超低溫冰箱保存，中途時間小于30 min，所有標(biāo)本收集完成后，統(tǒng)一在青海大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室進行后續(xù)處理和RT-qPCR操作。標(biāo)本的收集工作均經(jīng)患者和患者家屬知情同意，并通過青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理證實為早期浸潤性乳腺癌；②術(shù)前未行化療、放療和內(nèi)分泌治療；③年齡18～70周歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①發(fā)病前己有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶；②合并其他惡性腫瘤患者；③患者術(shù)前有器官移植病史或其他影響重要器官功能的重大疾病史；④拒絕簽收知情同意書的患者。

1.3主要試劑及設(shè)備 實驗miR-424與U6引物序列由北京天根生化科技有限公司設(shè)計合成，miRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒和miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒，北京天根生化科技有限公司。引物序列：miR-424-5p上游引物5′-CTCGAGAACTCGAGTCACCCACTACGTTGTTCCAAG-3′，下游引物5′-GAATTCAAGAATTCGGTGGTATTCTGATTGGGAAGG-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。7500 Fast實時熒光定量PCR儀，美國ABI公司，核酸蛋白檢測儀，美國Thermo公司。

1.4實驗方法 采用離心柱法提取組織總RNA，經(jīng)超微量核酸分析儀鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0，說明提取的總RNA濃度和純度合格，可用于后續(xù)實驗。PCR反應(yīng)體系共20 μl：2×miRcute增強型miRNA定量預(yù)混試劑盒(SYBR&ROX) 10 μl，正向引物1 μl，反向引物0.4 μl，miRNA第一鏈 cDNA 2 μl，無RNA酶雙蒸水6.6 μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min，94℃變性20 s，60℃退火、延伸34 s，一共進行40次循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.5統(tǒng)計分析 采用SPSS19.0軟件行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miRNA-424在乳腺癌組織中表達呈低表達 乳腺癌組織中miRNA-424的相對表達量為(0.38±0.10)，癌旁組織miR-424的相對表達量為(1.32±0.16)，miR-424在乳腺癌組織中的表達量明顯低于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

2.2miR-424與乳腺癌患者臨床病理特征關(guān)系 在癌組織中miR-424的相對表達量與患者年齡、民族、月經(jīng)史、孕次、產(chǎn)次、家族史、腫瘤部位、腫瘤直徑、病理陽性淋巴結(jié)數(shù)、病理TNM分期、腫瘤病理學(xué)類型、淋巴細(xì)胞浸潤、脈管瘤栓、神經(jīng)侵犯、人類表皮生長因子受體(HER)-2狀態(tài)、P53、膜蛋白質(zhì)P120和上皮型鈣黏附分子(E-CA)沒有相關(guān)性(P>0.05)；而與患者腫瘤的組織分化程度、雌激素受體(ER)狀態(tài)、孕激素受體(PR)狀態(tài)、增殖細(xì)胞相關(guān)核抗原(Ki-67)、CK5/6、分子分型和表皮生長因子受體(EGFR)狀態(tài)相關(guān)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1～3。

表1 miRNA-424與乳腺癌患者人口統(tǒng)計學(xué)之間的相關(guān)性

表2 miRNA-424與乳腺癌患者腫瘤學(xué)之間的相關(guān)性

表3 85例乳腺癌患者病理特征之間的相關(guān)性

3 討 論

miR-424(嚙齒動物同源物miR-322)和miR-503是哺乳動物miR-15/107家族的成員，它們被H19X基因簇編碼，位于人類染色體Xq26.3，miR-15/107家族的共享“種子”序列為“AGCAGC”，miR-424的表達比其他miR-15/107家族成員更具動態(tài)性和組織限制性，miR-15/107家族僅表達于脊索動物，其中miR-195、miR-497、miR-503、miR-424和miR-646具有哺乳動物特異性〔3〕。miR-424參與多種的腫瘤發(fā)生和進展，主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、低氧、組織分化和重塑〔3，4〕。

本研究結(jié)果顯示miR-424可能是一個抑癌基因，在癌組織中低表達，其表達量與患者腫瘤的分化程度、ER狀態(tài)、PR狀態(tài)、Ki-67、分子分型、CK5/6和EGFR狀態(tài)相關(guān)。當(dāng)miR-424低表達時，分化程度也低，ER和PR狀態(tài)也表達更低，而Ki-67表達水平更高，分子分型較差，預(yù)示著惡性程度增加。Wang等〔5〕分析了84例基底樣乳腺癌患者臨床病理特征與miR-424-5p相對表達量的關(guān)系，得出miR-424-5p與基底樣乳腺癌的分期、腫瘤大小、陽性淋巴結(jié)數(shù)目、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和家族史有關(guān)。同樣也得出了，其在癌組織中呈低表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。最后，miR-424-5p的低表達與基底樣乳腺癌患者的臨床分期晚、腫瘤大、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)多、存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級較差相關(guān)，其研究結(jié)果與我們的研究結(jié)果一致。Rodriguez-Barrueco等〔6〕同樣報道了，miR-424(322)/503簇在乳腺癌中是低表達的，敲除該基因后可以增加乳腺癌化療的耐藥性。

在其他腫瘤中，miR-424也發(fā)揮著重要的作用。Xu等〔7〕發(fā)現(xiàn)宮頸癌與正常組織比較miR-424下調(diào)，通過定量RT-PCR檢測147個宮頸癌組織與74個宮頸正常組織，發(fā)現(xiàn)miR-424在癌組織中的表達顯著降低。同樣發(fā)現(xiàn)miR-424的低水平表達與腫瘤分化差、臨床分期晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移多及其他不良預(yù)后臨床病理參數(shù)呈正相關(guān)。Zhou等〔8〕發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織和細(xì)胞中miR424-5p的表達顯著降低。Xu等〔9〕發(fā)現(xiàn)miR-424(322)通過阻斷細(xì)胞程式死亡-配體(PD-L)1免疫檢查點激活T細(xì)胞免疫應(yīng)答逆轉(zhuǎn)化療耐藥性。癌組織中高水平的miR-424(322)與卵巢癌患者的無進展生存期呈正相關(guān)。Liu等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)miR-424-5p在上皮性卵巢癌(EOC)組織和細(xì)胞系中明顯低表達。miR-424-5p水平與EOC腫瘤大小、TNM分期、病理分級和淋巴轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。Quan等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-424在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中通過靶向E2F7抑制腫瘤。證明了miR-424在人子宮內(nèi)膜癌中下調(diào)，并且抑制人類Ishikawa和HEC-1B子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系的生長。Wen等〔12〕發(fā)現(xiàn)在ESCC組織和細(xì)胞系中miR-424-5p的表達水平均降低。此外，miR-424-5p的表達水平與食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)組織中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)呈負(fù)相關(guān)。Peng等〔13〕發(fā)現(xiàn)在舌鱗狀細(xì)胞癌附近組織中miR-424表達下調(diào)，miR-424的水平在舌鱗狀細(xì)胞癌中上調(diào)。有趣的是，與正常舌組織相比miR-424在癌旁組織中表達下調(diào)，表明miR-424可能是該腫瘤減退的標(biāo)志。Zhang等〔14〕發(fā)現(xiàn)miR-424-3p的下調(diào)與非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)進展和總體預(yù)后相關(guān)，并且miR-424-3p和-5p都能阻礙NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。綜上，可以推測miR-424在不同的惡性腫瘤扮演著不同的作用，但在宮頸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、NSCLC、舌鱗癌及食管癌中表達均降低，并且與腫瘤的惡性程度都有一定關(guān)系，與本研究結(jié)果相類似。

綜上所述，miR-424可能是一個抑癌基因，在癌組織中低表達。其表達量與患者腫瘤的分化程度、ER狀態(tài)、PR狀態(tài)、Ki-67、分子分型和EGFR狀態(tài)相關(guān)。結(jié)合目前相關(guān)文獻，miR-424在其他腫瘤的研究結(jié)果與本研究結(jié)果相類似，都是低表達，并且與患者的臨床病理特征相關(guān)。但是，還需要進一步研究其可能的作用機制及相關(guān)作用靶點，更加清晰地認(rèn)識miR-424在乳腺癌中的重要作用。