壯藥龍鉆通痹方影響類風濕關節炎大鼠成骨細胞轉錄因子Smad5的時序性分析

田照 龐宇舟 袁德培 方剛 張曼 王文晟 余遠鵬

(1湖北民族大學醫學院，湖北 恩施 445000；2廣西中醫藥大學壯醫藥學院)

類風濕關節炎(RA)是一種好發于中年肥胖女性及老年群體的自身免疫性疾病，以小關節對稱性炎癥和骨質進行性破壞為主要特征〔1〕。在北歐及北美地區RA患病率為0.5%～1.0%，中國地區約為0.42%，隨著人口老齡化加劇及死亡率下降，預計本病的患病率將會繼續提高〔2,3〕。現代醫學治療RA以改善病情的抗風濕病藥(DMARDs)為主，聯合皮質類固醇、生物制劑或化學合成劑等〔4〕。上述方法通常可取得較好的療效，能夠延緩病情進展，但治療期間的一些副作用如肝損害、骨髓抑制等也不容忽視。故探索療效可靠且副作用小的替代藥物或輔助療法一直是當今醫學界努力的方向。

龍鉆通痹方由飛龍掌血、大鉆、兩面針、五指毛桃根、八角楓、雞血藤、青風藤、九龍藤八味壯藥構成。前期研究證實本方可降低患者紅細胞沉降率，改善關節疼痛麻木，縮短晨僵時間，有助于延緩病情，降低致殘率〔5〕。其作用機制可能與調控Toll樣受體(TLR)4/核因子(NF)-κB信號通路，降低白介素(IL)-6等炎癥因子及TLR4、髓樣分化因子(MYD)88基因表達有關〔6〕。同時，研究顯示龍鉆通痹方干預膠原誘導性關節炎(CIA)模型大鼠可減少滑膜組織炎癥細胞浸潤，下調大鼠血清和滑膜勻漿液中死亡受體Fas表達，同時提高死亡受體配體FasL的表達水平。故推測龍鉆通痹方治療RA可能也與調控Fas/FasL系統有關〔7〕。

RA的致畸致殘與骨內穩態失衡有密切關系，骨基質不斷被破骨細胞吸收，隨后由成骨細胞替代形成新骨，由此形成骨重建進而達到骨內穩態平衡〔8,9〕。成骨細胞是維持骨骼結構和調節骨微環境穩態的關鍵，已有研究證實，Smad5是成骨細胞分化調控通路骨形態發生蛋白(BMP)/Smads的重要調節因子之一，在促進骨祖細胞向成骨細胞分化及維持骨穩態方面起著非常關鍵的作用〔10,11〕。在關節炎條件下，Smad5表達降低，成骨細胞分化信號亦隨之減弱，致使骨礦化失常、骨質丟失、關節軟骨和軟骨下骨逐漸遭受破壞〔12〕。故促進成骨細胞分化、增加骨細胞基數，對維持骨的正常結構及最終防止RA致殘具有重大意義。本研究擬探討龍鉆通痹方對成骨細胞分化轉錄因子Smad5的影響及時序性關系。

1 材料與方法

1.1實驗材料 雄性SPF級SD大鼠96只，體重180～220 g(湖南斯萊克景達，SCXK(湘)2016-002)。龍鉆通痹方(顆粒劑)，批號20180508。

大鼠Smad5酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(武漢華美生物工程)；Smad5抗體、弗氏完全佐劑(美國Sigma)；三氯甲烷、異丙醇(成都科隆)等。

智能熱板儀(成都盟泰，RB-200)；全自動實時熒光定量PCR儀(瑞士羅氏，Light Cycler96)；多功能酶標儀(瑞士TEACAN ，M200)；高速冷凍離心機(Sigma，3K15)；研究型倒置顯微鏡(德國萊卡，DM18)等。

1.2模型制備 將96只SD大鼠適應性喂養1 w后隨機分為正常組、模型組、西藥組、壯藥組，每組24只，每組分為四個亞組，分別是7、14、21、28 d亞組。除正常組外，參照文獻〔13〕中所述方法制備佐劑性RA大鼠模型，即在大鼠右后足底注射弗氏完全佐劑0.15 ml，1 w后在其尾根部再次注射0.1 ml。壯藥組灌胃龍鉆通痹顆粒溶液〔0.54 g/(100 g·d)〕，西藥組灌胃甲氨蝶呤(2.7 mg/kg)，正常組、模型組分別灌胃等體積蒸餾水，灌胃總時間為21 d，分別在第7、14、21天進行前3次取材，停藥1 w后，第4次取材。所取組織為全血、膝關節軟骨及右后踝關節以下骨組織。造模期間無動物死亡，全部納入數據分析。

1.3觀察指標

1.3.1RA模型大鼠形態指標觀察

1.3.1.1RA大鼠足底熱板痛閾值檢測 每只大鼠測試前在熱板儀中適應性活動5 min，然后打開熱板儀，恒溫50℃，記錄大鼠第一次舔后足的熱痛時間，每只大鼠檢測3次，取平均值。

1.3.1.2RA大鼠關節腫脹度檢測 以游標卡尺測大鼠造模前后右后足的腫脹度，造模前1 d測量1次；造模后給藥第7、14、21天，停藥1 w后的第28天分別測量1次。公式：腫脹度=(注射后足跖厚度-注射前足跖厚度)/注射前足跖厚度。

1.3.2實時熒光定量(RT)-PCR檢測RA大鼠膝關節軟骨Smad5 mRNA表達 液氮研磨關節軟骨，提取總RNA，測定總RNA濃度，按逆轉錄試劑盒合成cDNA，反應條件為42℃15 min，95℃3 min。Smad5(目的基因)引物委托上海生工生物工程有限公司合成，上游引物：5'-TACCTCCAGTGTTAGTGCCTCGTC-3'，下游引物：5'-GTGCGGCTCATTGTGGCTCAT-3'；內參GAPDH上游引物：5'-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3'，下游引物：5'-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'。按擴增試劑盒配制擴增體系(20 μl)，采用兩步法擴增，總共40個循環。

1.3.3Western印跡檢測RA大鼠關節軟骨Smad5蛋白表達 從-80℃冰箱取出關節軟骨，液氮中研磨提取蛋白，測蛋白濃度，制備8%的分離膠及5%的濃縮膠，80 V壓縮濃縮膠，120 V電泳至條帶到底，275 mA轉模60 min，TBST洗膜3次，隨后封閉60 min。 Smad5、內參GAPDH、一抗、二抗均按說明書進行稀釋， 4℃孵育一抗過夜，第2天TBST洗膜后室溫孵育二抗60 min，最后配A、B發光液顯影。

1.3.4ELISA檢測RA大鼠血清Smad5蛋白含量 從-80℃冰箱取出已分裝好的血清，嚴格按照試劑盒步驟操作。

1.3.5大鼠踝關節形態學檢測 常規石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察踝關節軟骨組織形態學病理改變。

1.4統計學方法 采用SPSS19.0軟件,計量資料組間對比行單因素方差分析，兩兩組間比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1龍鉆通痹方對RA大鼠足底熱板痛閾值的影響 與正常組比較，其余各組足底痛覺敏感，閾值時間短(P<0.05)；與模型組相比，壯藥組與西藥組在第7、14、21、28天痛閾值均明顯高于模型組(P<0.05)，相比其他時間段，第21天時段與正常組略接近，但也有顯著差異(P<0.05)，說明痛閾值與其給藥時間有一定關連性。與西藥組相比，壯藥組未見顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組足底熱板痛閾值比較

與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.2龍鉆通痹方對RA大鼠足跖關節腫脹度的影響 與正常組比較，其余各組關節腫脹明顯(P<0.05)；與模型組比較，壯藥組與西藥組在給藥14 d后腫脹度均明顯下降，在21 d腫脹下降最明顯(均P<0.05)；與西藥組比較，壯藥組未見顯著性差異(P>0.05)。見表2。

2.3龍鉆通痹方對RA大鼠關節軟骨Smad5 mRNA表達的影響 與正常組比較，除21 d時段壯藥組與西藥組Smad5 mRNA表達接近于正常組(P>0.05)。以外，其余各組各時段Smad5 mRNA表達明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)；第14～28天，壯藥組、西藥組Samd 5 mRNA表達明顯高于模型組(P<0.05)，壯藥組與西藥組間比較無顯著差異(P>0.05)。見表3。

2.4龍鉆通痹方對RA大鼠關節軟骨Smad5蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組各時間段Smad5蛋白表達均明顯降低(P<0.05)；壯藥組與西藥組在21 d時段Smad5蛋白表達最高，但仍明顯低于正常組(P<0.05)；與模型組比較，壯藥組、西藥組第14天開始明顯上調(P<0.05)。壯藥組與西藥組無顯著差異(P>0.05)。見圖1，表4。

表2 各組足跖腫脹度檢測

表3 各組關節軟骨Smad5 mRNA時序性比較

圖1 各組大鼠Smad5蛋白的組間及時序性表達

組別7 d14 d21 d28 d壯藥組0.56±0.051)0.75±0.101)2)0.93±0.031)2)0.77±0.081)2)西藥組0.51±0.031)0.86±0.081)2)0.98±0.081)2)0.80±0.061)2) 模型組0.42±0.081)0.44±0.071)0.43±0.051)0.46±0.071) 正常組1.13±0.131.17±0.201.05±0.191.14±0.15

2.5龍鉆通痹方對RA大鼠血清Smad5蛋白含量的影響 與正常組比較，其余各組各時間段Smad5蛋白含量均明顯下調(P<0.05)，21 d時段壯藥組與西藥組Smad5蛋白含量略接近于正常組，但差異仍有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，壯藥組與西藥組在給藥21 d開始Smad5蛋白含量明顯上調(P<0.05)。見表5。

2.6龍鉆通痹方對RA大鼠病理學形態變化的影響 正常組大鼠踝關節滑膜光滑無增生，層次清晰，軟骨細胞分布規律，未見炎癥浸潤(圖2A)。與正常組比較，模型組滑膜表面增生明顯，關節腔變窄(圖2B)，見炎性滲出伴大量淋巴細胞分布(圖2C)，圖2C為圖2B黑色星號處高倍鏡下展示。與模型組比較，壯藥組灌胃7 d后仍可見大量炎癥細胞，軟骨細胞分布較少(圖2D)；14 d后可見炎性浸潤減少，滑膜表面較光滑(圖2E)；21 d后軟骨細胞排列整齊，淋巴細胞減少(圖2F)。西藥組給藥7 d后關節滑膜仍可見大量炎性滲出和淋巴細胞，關節腔狹窄，滑膜層次不清晰(圖2G)；14 d后見炎癥細胞減少，軟骨細胞增多，排列較整齊(圖2H)；給藥21 d后關節腔清晰，炎性滲出不明顯，滑膜層次減少，表面光滑(圖2I)。

表5 各組血清Smad5蛋白時序性比較

圖2 各組大鼠踝關節HE染色比較(×100)

3 討 論

RA是以滑膜異常增殖，血管翳形成，軟骨破壞及鈣流失為其主要病理改變的全身性炎癥性疾病〔14〕。隨著病情加劇，患者小關節易致畸致殘，喪失勞動力，嚴重影響患者心理健康及生活質量，加重經濟成本和社會負擔〔15〕。所以，如何防治RA，延緩病程及防止致畸致殘已是世界級醫學難題。由于RA的軟骨破壞與成骨細胞分化程度密切相關，故探索與成骨細胞分化的通路調控因子也是當今研究的熱點話題。

越來越多的傳統中藥已被發現對下調骨吸收促進因子及上調骨保護因子進而維持破骨-成骨平衡具有重要作用，民族醫藥中的壯醫熱敏探穴針刺療法，藏醫內服外浴結合法等在治療RA的過程中都取得了較好的療效〔16～19〕。故在傳統醫學領域積極尋找較好的RA治療方法前景廣闊。已有研究顯示，Smad5是成骨細胞分化BMP/Smad通路中不可缺失的一環，Smad5表達升高可提高骨祖細胞向成骨細胞分化的轉化率，有利于新骨的形成〔20〕。龍鉆通痹方主藥為飛龍掌血和大鉆，飛龍掌血主要化學成分為生物堿、香豆素、黃酮等，用其提取物干預RA小鼠模型，可減輕爪和關節腫脹度，使關節骨和軟骨遭受破壞的程度明顯低于對照組〔21,22〕；大鉆具有抗炎、抗氧化、提高免疫力等作用，對風濕性疾病引發的痛癥效果顯著〔23〕。

本研究西藥組Smad5 mRNA及蛋白表達略高于壯藥組，可能與RA的頑固性有關。在沒有西藥干預的條件下，傳統方式需要多途徑多療法予以治療；而西藥對比傳統藥物來說起效時間相對較快。本研究認為龍鉆通痹方干預佐劑性RA模型大鼠的起效時間可能從1 w后開始，在14～21 d時間段達到效應峰值。由于未在RA患者群中做時序性研究，后期將結合臨床予以完善，為RA防治策略提供理論支撐。