雛菊葉龍膽酮對小鼠腦缺血損傷模型的影響及機制

鄭渤 胡慧敏 趙志英 陳彪 李彪 云娜

(1內蒙古科技大學包頭醫學院麻醉學院，內蒙古 包頭 014040；2內蒙古巴彥淖爾市醫院麻醉科；3內蒙古科技大學包頭醫學院麻醉學專業2016級本科生)

缺血性腦血管病是神經內科常見疾病，且已成為我國國民死亡的首要原因。但目前的臨床治療手段非常有限，有限的時間窗內溶栓及介入治療雖然可以降低死亡率，但腦缺血損傷的藥物治療仍然是目前阻礙治療的世界性難題。龍膽科獐牙菜屬植物，為我國傳統蒙藥藥用植物。研究發現，龍膽科植物中分離提取得到的化合物——雛菊葉龍膽酮具有廣泛的生物學活性作用，如抗氧化、抗菌、抑制膽堿酯酶及單胺氧化酶、保護心血管系統等〔1,2〕。本課題組前期研究從內蒙古道地藥材尖葉假龍膽(蒙藥名：阿古特-其其格)中分離提取出雛菊葉龍膽酮(Bellidifolin)，并發現具有一定的抗腦缺血作用，其作用機制可能與通過抑制氧化應激反應和抑制興奮性氨基酸產生、提高腦組織γ-氨基丁酸(GABA)含量有關〔3〕。本研究擬通過結扎小鼠雙側頸總動脈的方法復制動物腦缺血損傷模型，探究雛菊葉龍膽酮對缺血性腦損傷的保護作用及其作用的信號通路。

1 材料與方法

1.1實驗材料 3月齡健康雄性C57BL小鼠30只，由內蒙古科技大學實驗室提供，Scxk(蒙)2016-0001。雛菊葉龍膽酮購自四川維克奇生物科技有限公司(純度均≥98%)，兔抗細胞外調節蛋白激酶(ERK)、氨基末端激酶(JNK)、p-38MAPK、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3購自CST公司。 體重(25.7±1.5)g，按照隨機數字表將小鼠隨機分為假手術(C)組、腦缺血損傷(AD)組、 雛菊葉龍膽酮高劑量組(100 mg/kg，H組)、中劑量組(75 mg/kg,I組)、低劑量組(50 mg/kg,L組)，每組6只。

1.2腦缺血模型的建立 將小鼠用質量分數4%的水合氯醛(1 ml/100 g)腹腔麻醉后，仰臥固定于操作臺上，備皮、消毒后于頸前正中部位做一個1～2 cm的矢狀切口，氣管兩側分離出雙側頸總動脈、迷走神經，動脈夾夾閉雙側頸總動脈，觀察小鼠的瞳孔大小和翻正反射。腦缺血模型制作成功的標準是夾閉雙側頸總動脈2 h后雖正反射消失，雙側瞳孔放大但可以自主呼吸。實驗過程中小鼠出現抽搐癥狀或小鼠死亡即建立模型失敗。

1.3Western印跡檢測相關蛋白表達 小鼠麻醉后，斷頭取腦，冰上分離雙側腦皮質、海馬備用。分離腦組織并超聲粉碎，提取蛋白，并用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測定蛋白濃度。瓊脂糖凝膠電泳后運用ImageJ圖像分析軟件測得條帶灰度值，將各目的條帶與內參條帶比值后，比較各組間差異。

1.4統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組腦組織caspase-3蛋白表達水平比較 與C組(0.365±0.018)比較，AD組缺血側腦組織caspase-3蛋白表達水平(0.843±0.051)顯著增加(P<0.05)；L組、I組、H組(0.805±0.023、0.674±0.053、0.313±0.009)顯著低于AD組(P<0.05)，且與劑量呈相關性，見圖1。

2.2各組腦組織p38MAPK蛋白表達水平 與C組(0.412±0.015)比較，AD組缺血側腦組織p38MAPK蛋白表達水平(1.179±0.102)顯著增加(P<0.05)；L組、I組、H組(0.871±0.031、0.762±0.101、0.631±0.017)顯著低于AD組(P<0.05)，且與劑量呈相關性。見圖2。

圖1 各組腦組織caspase-3蛋白表達

圖2 各組腦組織p-p38MAPK蛋白表達

2.3各組腦組織p-JNK蛋白表達水平 與C組(0.447±0.059)比較，AD組缺血側腦組織p-JNK蛋白表達水平(1.151±0.071)顯著增加(P<0.05)；L組、I組、H組(0.100±0.011、1.010±0.052、0.712±0.102)顯著低于AD組(P<0.05)，且與劑量呈相關性。見圖3。

圖3 各組腦組織p-JNK蛋白表達

2.4各組腦組織p-ERK蛋白表達水平 與C組比較，AD組腦組織p-ERK表達變化不明顯。見圖4。

圖4 各組腦組織p-ERK蛋白表達

3 討 論

腦缺血損傷是由于一系列復雜的生化和分子機制如促凋亡蛋白和促炎細胞因子等因素導致的大腦、小腦及腦干等局部或多部位缺血，進而引起相關神經功能異常的疾病〔4〕。由于腦血管疾病具有高發病率、高致殘率及高死亡率等特點，已成為中老年患者獲得最佳療效的主要難題〔5〕。雖然目前臨床應用的西醫手段如介入治療等效果顯著，但術后不良反應、高額的手術費用及可能的二次灌注損傷都是亟待解決的問題。中藥有效成分由于其作用明顯，安全性高，臨床療效顯著，通過多途徑發揮作用而成為國內外研究的熱點和前沿〔6，7〕。

體外實驗表明，雛菊葉龍膽酮對低氧誘導的PC12細胞損傷具有保護作用，雛菊葉龍膽酮抑制細胞凋亡，機制是通過抑制p38MAPK信號通路激活下游caspase-3、提高Bcl-2/Bax的表達而實現〔7〕。雛菊葉龍膽酮又名雛菊葉龍膽素，主要存在于龍膽科獐牙菜屬、假龍膽屬、龍膽屬植物中〔8〕。研究表明，雛菊葉龍膽酮具有多種生物學活性，高佳琪〔9〕研究發現，雛菊葉龍膽酮可改善糖代謝促進糖消耗，發揮降血糖作用，其機制可能是雛菊葉龍膽酮參與調控胰島素的基因表達，影響相關蛋白的磷酸化水平及蛋白表達水平。有研究表明，雛菊葉龍膽酮可能通過減輕氧化應激水平，發揮對胰島的保護作用〔10〕。雛菊葉龍膽酮可以在人體內的內皮轉化過程中對過氧化氫(H2O2)誘導的氧化應激反應發揮保護作用〔11〕。雛菊葉龍膽酮參與神經損傷后的修復，雛菊葉龍膽酮可促進坐骨神經損傷后功能恢復，可促進神經功能恢復〔12〕。

MAPK信號轉導通路可以參與調控多種細胞生物學效應，尤其是在細胞增殖、分化及凋亡過程中，是多種信號轉導途徑的共同作用部位。MAPK被激活后轉移至細胞核內，使一些轉錄因子發生磷酸化，改變細胞內基因表達的狀態。有研究認為ERK通路的激活主要是促進細胞存活和抑制凋亡，而JNK和p-38MAPK通路的激活主要與細胞凋亡有關〔13〕。p-38MAPK已被證明可以通過激活其下游的激酶和轉錄因子，加速細胞凋亡，造成腦缺血損傷的進一步發展〔14〕?；罨腏NK參與調節細胞的增殖分化、凋亡、胚胎發育、癌基因的轉化等多種生命過程，JNK代表了保護腦免受缺血性腦卒中的治療靶點〔15〕。本課題組前期研究表明，雛菊葉龍膽酮可有效抑制低氧所致的PC12細胞凋亡，其機制可能與抑制p-38MAPK信號通路的活化及下游caspase-3的表達有關〔16〕。本研究發現，雛菊葉龍膽酮可以下調p-38MAPK、p-JNK的表達，進而降低腦缺血引起的caspase-3表達升高，抑制腦組織細胞凋亡。再次證明雛菊葉龍膽酮具有一定的抗腦缺血作用，其通過影響MAPK信號轉導通路參與對缺血損傷細胞凋亡程度的調控。