中藥千金子對腎癌Renca細胞凋亡的影響及其機制

趙俊峰 李豪 雷震 張嘉琪 張林超 孫繼建 潘世杰 蘇曉斐 肖耀軍

(河南省中醫(yī)院 河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院 1泌尿外科，河南 鄭州 450002；2中心實驗室；3武警廣東總隊醫(yī)院泌尿外科)

千金子亦稱“蒲薩豆、千兩斤”是大戟科類植物隨續(xù)子Euphorbia lathyris L的干燥成熟的種子〔1〕。最早在20世紀20年代已有國外學者對大戟科類中藥千金子進行了相關研究，現(xiàn)代科學研究也表明千金子具有抗多種腫瘤細胞的藥理學活性，臨床已有報道千金子用于治療食管癌、皮膚腫瘤、急性淋巴細胞性白血病等均有較好的療效〔2〕。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)千金子二萜醇對腎癌Renca細胞具有較強的抑制作用〔3,4〕，但是其對腎癌Renca細胞凋亡及其機制的影響尚不清楚。本研究以腎癌Renca細胞為模型，運用流式細胞技術，十二烷基硫代硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)技術，檢測千金子二萜醇作用后腎癌Renca細胞凋亡的變化情況，探討千金子引起腎癌Renca細胞凋亡可能的分子機制。

1 材料和方法

1.1材料與試劑 小鼠腎癌Renca細胞購買自北京鼎國昌盛生物科技有限公司。千金子二萜醇(批號：wkq18030201 CAS:34420-19-4，純度：HPLC≥98%,規(guī)格：20 mg/支，四川維克奇生物科技有限公司)，將藥品溶解到200 μl的二甲基亞砜(DMSO)中，細胞實驗前使用RPMI-1640培養(yǎng)基進行溶解，經(jīng)過濾除細菌后稀釋至實驗所需的濃度備用。主要試劑如RPMI-1640培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、胎牛血清、胰蛋白酶均購自Hyclone公司；AnnexinV-FITC細胞凋亡的試劑盒購于凱基生物科技有限責任公司。本實驗所用的一抗、二抗均購買于美國Rockland公司。雙抗(青霉素、鏈霉素)、BCA測量蛋白濃度試劑盒購買自武漢漢恒生物科技有限公司；裂解細胞液(RIPA和PMSF)購于上海碧云天生物科技有限公司。實驗儀器有細胞實驗超凈工作臺(上海凈化設備公司)；CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo,美國)；倒置顯微鏡(日本，Canon)；流式細胞儀為美國貝克曼公司生產(chǎn)的產(chǎn)品；TDZ4-WS型低溫高速離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司生產(chǎn))；恒溫水浴鍋(上海機器設備廠生產(chǎn))。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 從-80℃的冰箱中取出凍存的腎癌Renca細胞，置于37℃恒溫水浴鍋中迅速復蘇。腎癌Renca細胞培養(yǎng)于體積分數(shù)為10%的胎牛血清、青霉素及鏈霉素各100 U/ml的RPMI1640細胞培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2濃度、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，當細胞融合達到75%～80%以上，胰蛋白酶消化傳代。細胞呈單層貼壁后，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2細胞凋亡的檢測 同樣取對數(shù)生長期的腎癌Renca細胞，用單純RPMI1640調(diào)整細胞密度為3×105/ml，同樣均勻加樣于6孔細胞培養(yǎng)板置于細胞恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h待貼壁后實驗組加入千金子二萜醇(9 000 μg/ml)，對照組加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，預處理細胞，再常規(guī)培養(yǎng)24 h后，使用5%的不含EDTA胰酶消化后，加入培養(yǎng)基收集細胞2 000 r/min離心2次。嚴格按照試劑盒操作步驟：依次加入500 μl的緩沖液、5 μl AnnexinV、5 μl PI后常溫避光反應30 min，于1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，所得結(jié)果用Flowjob軟件分析。

1.2.3Western印跡法檢測腎癌Renca細胞凋亡相關蛋白的表達 將細胞接種到6孔板中，實驗組和對照組各3復孔。37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，藥物作用腎癌Renca細胞24 h后，提取總蛋白，BCA蛋白濃度試劑盒檢測蛋白的擬合濃度曲線、并計算上樣濃度。然后取50 μg蛋白進行SDS-PAGE實驗，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%的脫脂高鈣奶粉37℃封閉1.5 h，根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小進行裁剪，TBST洗膜共5次，每次5 min。一抗放置于4℃冰箱孵育過夜，加入二抗常溫孵育2 h后，泡入顯影液。隨后在ChemiDoc成像系統(tǒng)中進行ECL曝光顯影,與β-actin做內(nèi)參對照。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS24.0統(tǒng)計學軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1千金子對腎癌Renca細胞凋亡的影響 與對照組早期凋亡率〔(3.8±3.12)%〕和晚期凋亡率〔(7.2±2.46)%〕相比較，千金子作用于小鼠腎癌Renca細胞24 h后，細胞的早期凋亡率〔(28.3±2.16)%〕和晚期凋亡率〔(36.7±4.13)%〕均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2千金子對腎癌Renca細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的影響 與對照組相比較，千金子作用腎癌Renca細胞后凋亡蛋白Caspase-3的表達水平顯著提高，促凋亡蛋白Bax表達水平亦有所增高，而抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達水平顯著下降，見圖1。

圖1 Western印跡檢測千金子對Renca細胞凋亡相關蛋白的影響

3 討 論

腎癌是嚴重威脅人類生命健康的泌尿系常見惡性腫瘤，占成人全身惡性腫瘤的2%～3%〔5〕，并且每年腎癌的發(fā)病率以2.5%速度不斷增加〔6〕。絕大多數(shù)腎細胞癌發(fā)病較為隱匿，而且對放化療缺乏敏感性，縱然外科手術是腎癌治療的唯一有效方法，仍有不少患者術后再次出現(xiàn)復發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，尋求腎細胞癌新的治療途徑，對于延長患者的壽命、改善患者的生活質(zhì)量將有著重大的意義。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，中藥千金子對小鼠腎癌Renca細胞具有較強的細胞毒作用，當藥物濃度達到9 000 μg/ml時抑制率高達64.65%〔3〕，基于前期實驗研究的基礎，我們進一步研究了千金子對腎癌Renca細胞凋亡,揭示千金子抗腫瘤凋亡分子機制。

細胞凋亡的生物學事件是由基因決定的程序性死亡，腫瘤細胞無限制的增殖與腫瘤細胞的凋亡減少有關〔7〕。細胞的凋亡途徑主要包括內(nèi)部的線粒體途徑和外源性死亡受體介導信號傳導的兩大經(jīng)典途徑，兩條途徑最終激活Caspase引起腫瘤細胞發(fā)生凋亡〔8,9〕。線粒體途徑細胞凋亡主要有賴于促凋亡基因Bax及抗凋亡基因Bcl-2表達的抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白相互影響，參與形成細胞生命活動的調(diào)控，并在凋亡因子的刺激下激活下游的Caspase級聯(lián)反應，誘導細胞凋亡的發(fā)生〔10〕。本研究表明千金子作用腎癌Renca細胞后，與對照組相比較促凋亡蛋白Bax的表達水平有所升高、抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平下降、半胱氨酸蛋白酶Caspase-3出現(xiàn)裂解片段，而且表達水平明顯升高；Hsieh等〔11〕研究報道了千金子通過抑制Bcl-2的表達，促進Bax的表達水平降低線粒體細胞色素C，最終誘導宮頸癌細胞凋亡，與本研究的結(jié)果一致；Gillespie等〔12〕和Fallahian等〔13〕的研究均證實千金子是通過線粒體凋亡的途徑誘導黑色素瘤細胞和A357細胞發(fā)生凋亡，提示中藥千金子誘導腎癌Renca細胞的凋亡的分子生物學機制不僅與影響腎癌細胞內(nèi)凋亡蛋白與抗凋亡蛋白的表達相關，還很可能與影響腎癌細胞線粒體膜電位的變化有關。然而，中藥千金子抗腫瘤作用方面的研究基本停留在體外細胞實驗水平，千金子的動物體內(nèi)抗腫瘤相關的研究有待進一步研究。