miR-134通過(guò)介導(dǎo)CCND1表達(dá)下調(diào)抑制食管癌細(xì)胞增殖

李麗娜

(許昌學(xué)院醫(yī)學(xué)院,河南 許昌 461000)

食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)在我國(guó)的發(fā)病率逐年升高〔1〕。ESCC患者早期多以胃部燒灼感和吞咽不適等非特異性表征為主，難以獲得早期診治。深入研究ESCC進(jìn)展機(jī)制及診斷標(biāo)志物對(duì)實(shí)現(xiàn)食管癌的二級(jí)預(yù)防具有重要意義。微小RNA(miRNA)是單鏈的長(zhǎng)度較短的RNA，通常其堿基數(shù)量在22 bp左右〔2〕。miRNA的異常表達(dá)已在ESCC中被證實(shí)，其與細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移〔3〕及血管新生〔4〕有關(guān)。miR-134已被查明在多種婦科腫瘤，包括子宮內(nèi)膜癌〔5〕及乳腺癌〔6〕中的表達(dá)水平顯著下調(diào)。目前，miR-134在ESCC中的含量及生物功能尚不明確。本課題擬研究miR-134在ESCC中的表達(dá)水平；利用慢病毒感染特異性上調(diào)ESCC細(xì)胞中miR-134的表達(dá)水平，探究miR-134對(duì)ESCC細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。

1 材料和方法

1.1臨床標(biāo)本 選取2015年1月至2018年1月于許昌學(xué)院醫(yī)學(xué)院收治并行手術(shù)切除的60對(duì)ESCC組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織(距腫瘤邊緣距離>2 cm)標(biāo)本，男34例，女26例，年齡(56±6)歲。

1.2細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)試劑 ESCC細(xì)胞TE-1于許昌學(xué)院醫(yī)學(xué)院細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室保存；慢病毒(miR-134及陰性對(duì)照)、引物(miR-134及U6)分別由廣州復(fù)能基因及廣州銳博生物科技有限公司提供；DMEM、胎牛血清、Trizol、RT-PCR試劑盒、DyNAmo Flash SYBR Green qPCR試驗(yàn)盒、細(xì)胞周期蛋白(CCN)D1抗體(ab134175)、β-actin抗體(ab8226)分別由美國(guó)Gibco、美國(guó)Invitrogen公司和美國(guó)abcam公司提供；噻唑藍(lán)(MTT)藥物、膜聯(lián)蛋白(Annexin)-V/碘化丙啶(PI)凋亡檢測(cè)試劑盒由上海生工生物有限公司提供。

1.3qRT-PCR RNA由Trizol試劑按說(shuō)明書(shū)提取。按說(shuō)明分別組建RT-PCR及real-time PCR體系。RT-PCR條件：反轉(zhuǎn)錄，50℃ 30 min；變性，94℃ 2 min；共1循環(huán)。Real-time PCR條件：變性，94℃ 15 s；退火，60℃ 30 s；延伸，68℃ 3 min；共40循環(huán)；最后延伸，72℃ 10 min。通過(guò)2-△△Ct法計(jì)算基因相對(duì)含量。

1.4慢病毒感染 將TE-1細(xì)胞以合適密度接種于6孔板中。過(guò)夜培養(yǎng)后洗滌細(xì)胞。慢病毒感染分組：miR-134組每孔包括2 ml含血清DMEM、1 ml的miR-134慢病毒顆粒及15 μg聚凝胺；miR-NC組每孔包括2 ml含血清DMEM、1 ml的陰性對(duì)照慢病毒顆粒及15 μg聚凝胺。轉(zhuǎn)染2 d后，使用特性抗生素溶液篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TE-1細(xì)胞。

1.5MTT實(shí)驗(yàn) TE-1細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染24、48和72 h，按每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種96孔板，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置6個(gè)平行對(duì)照。培養(yǎng)過(guò)夜后加入MTT溶液，再次避光培養(yǎng)4 h。吸凈上清后每孔用150 μl二甲基亞砜(DMSO)溶液溶解MTT結(jié)晶。酶標(biāo)儀讀取490 nm處的OD值。

1.6平板克隆形成試驗(yàn) 在6孔板中均勻接種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的TE-1細(xì)胞，每孔約500個(gè)。培養(yǎng)2 w后，多聚甲醛固定細(xì)胞、1%結(jié)晶紫染色、蒸餾水漂洗、通風(fēng)櫥內(nèi)風(fēng)干培養(yǎng)板。計(jì)數(shù)克隆數(shù)量，百分法計(jì)算克隆形成率。

1.7流式細(xì)胞儀分析 轉(zhuǎn)染72 h后的TE-1細(xì)胞用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，胰酶消化后低速離心獲取細(xì)胞沉淀，取兩份含5×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，一份與10 μl PI溶液混合做細(xì)胞周期分析；一份與5 μl Annexin V-FITC及10 μl PI混合上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.8Western印跡 細(xì)胞總蛋白采用RIPA法提取，十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白，70 V濕轉(zhuǎn)120 min轉(zhuǎn)印目標(biāo)蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封閉液室溫封閉2 h后將目標(biāo)條帶分別置入CCND1和β-actin一抗溶液中在4℃下孵育過(guò)夜。1∶5 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗在室溫中孵育目標(biāo)條帶1 h。電化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯影，自動(dòng)曝光機(jī)固定條帶影像，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1ESCC組織中miR-134的表達(dá) miR-134在癌旁組織中的表達(dá)量(1.377±0.052)顯著高于ESCC組織(0.988±0.051；t=5.311，P<0.001)。

2.2miR-134對(duì)TE-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的影響 miR-134組中miR-134的表達(dá)顯著高于miR-NC組(14.27±4.03 vs 1.00±0.00；t=8.031，P<0.001)。MTT實(shí)驗(yàn)表明，感染72 h后，miR-134組細(xì)胞活力與miR-NC組相比顯著下降(0.58±0.09 vs 0.71±0.08；t=3.378，P=0.023)。平板克隆形成試驗(yàn)結(jié)果表明，與miR-NC組比較，miR-134組顯著下調(diào)了TE-1細(xì)胞的克隆形成能力〔(85.32±10.68)% vs (39.18±13.07)%；t=3.022，P=0.029〕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組平板克隆形成試驗(yàn)(×100)

流式細(xì)胞系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果表明，與感染miR-NC組相比，miR-134組細(xì)胞凋亡率明顯升高〔(12.16±5.23)% vs (37.28±6.14)%;t=4.382，P=0.010〕。見(jiàn)圖2。

2.3miR-134對(duì)TE-1細(xì)胞中CCND1表達(dá)的影響 通過(guò)生物信息學(xué)檢索發(fā)現(xiàn)CCND1的表達(dá)可能受到miR-134的靶向調(diào)節(jié)。見(jiàn)圖3。與miR-NC相比，miR-134組TE-1細(xì)胞內(nèi)CCND1 mRNA(1.00±0.00 vs 0.43±0.15;t=4.031，P=0.011)及蛋白(0.43±0.16 vs 0.12±0.03;t=2.106，P=0.042)水平均顯著降低。見(jiàn)圖4。這一結(jié)果提示CCND1是miR-134的作用靶點(diǎn)之一。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞凋亡率

圖3 miR-134與CCND1 mRNA 3′-UTR結(jié)合位點(diǎn)

圖4 Western印跡檢測(cè)兩組CCND1蛋白表達(dá)

3 討 論

miR-134位于人類第14號(hào)染色體。神經(jīng)科學(xué)研究顯示，miR-134對(duì)維持生物記憶有重要作用〔7〕，miR-134在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的維持對(duì)減輕癲癇所致神經(jīng)損傷有重要作用〔8〕。

本研究中通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)得知ESCC組織中miR-134的表達(dá)水平顯著下調(diào)，提示miR-134在食管癌中扮演潛在抑癌角色。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)環(huán)境中，miR-134能夠削弱癌細(xì)胞活力、增殖能力，并可以促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-134在消化道腫瘤〔9〕轉(zhuǎn)移及肺腫瘤〔10〕耐藥中也有調(diào)節(jié)作用。這些現(xiàn)象充分說(shuō)明了miR-134的多重抗癌作用，值得深入探究。

miRNA對(duì)靶基因具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制是通過(guò)與靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)(3′-UTR)區(qū)特異性結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)在線數(shù)據(jù)檢索發(fā)現(xiàn)，CCND1 mRNA的3′-UTR存在miR-134的結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人為升高miR-134對(duì)CCND1的表達(dá)具有負(fù)向調(diào)節(jié)效果。CCND1是已知的促食管癌增殖因子〔11，12〕。上述實(shí)驗(yàn)證明，miR-134對(duì)CCND1的表達(dá)調(diào)節(jié)作用可能是miR-134發(fā)揮抗食管癌的機(jī)制之一。