缺血性腦卒中患者血清中miR-191、miR-18a的表達與預后關系

張紅利，張智芳，白金娟，杜振峰

缺血性腦卒中又名腦梗死，是由腦供血動脈閉塞或狹窄，進而引發腦供血不足，從而造成腦組織壞死的臨床常見病癥，其致殘率及致死率常年居高不下，且預后效果不佳，嚴重影響患者社會活動及日常生活行為[1]。

微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是廣泛存在于組織和血液的單鏈RNA，能夠在基因轉錄過程中發揮調控作用，其在多種疾病中表達失調，可作為多種疾病診治靶標及預后評估指標[2]。患者發生缺血性腦卒中后，血清中miRNA常呈異常表達[3]。Du等[4]研究發現微小RNA-191(microRNA-191，miR-191)通過靶向VEZF1抑制血管生成，從而促進缺血性腦損傷，miR-191可以作為急性缺血性腦卒中的生物學標志或診療靶標。

微小RNA-18a(microRNA-18a，miR-18a)在老年急性心肌梗死患者血清中表達異常，可作為老年急性心肌梗死診療及病情評估的臨床指標[5]。但miR-191、miR-18a在缺血性腦卒中的研究鮮少，且兩者與預后的關系尚未發現有關報道。基于此，本研究初步研究miR-191、miR-18a在缺血性腦卒中患者血清中的表達水平，分析兩者對預后的影響，以期為動態監測缺血性腦卒中發病進程，并為臨床診斷及預后評估提供參考依據。

1 臨床資料與方法

1.1 一般臨床資料 選取2016年12月-2019年2月本院診治的118例缺血性腦卒中患者為腦卒中組，其中男67例，女51例；年齡38～74歲，平均年齡(56.02±9.05)歲。并選取同時間段內招募的健康體檢者114例，其中男60例，女54例；年齡37～72歲，平均年齡(55.87±8.94)歲。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有研究對象的吸煙史、高血壓史、心臟病史、糖尿病史進行調查，實驗室檢測低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、總膽固醇水平。

診斷標準：參照《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[6]。納入標準：(1)所有患者均符合缺血性腦卒中的診斷標準，均經MRI或頭部CT證實；(2)所有患者均接受缺血性腦卒中的常規保守治療；(3)生理病理診療資料完全者。預后排除標準：(1)合并血液病、帕金森病、惡性腫瘤者；(2)合并膠原病、自身免疫性疾病者；(3)近期出現急慢性感染、創傷、進行手術治療者；(4)蛛網膜下腔出血、腦出血者；(5)合并腎衰竭/腎功能不全者；(6)常規保守治療中死亡者。所有患者或患者家屬簽署知情同意書，且該研究經本院倫理委員會審核、批準后實施，符合《赫爾辛基宣言》。生活能力評分量表(Modified Rankin Scale，MRS)標準[7]：評分0～6分，0分表現為無癥狀；1分表現為有癥狀，可完成日常活動和工作；2分表現為輕度殘疾，不需幫助可自我照顧，但不可完成所有以往活動；3分表現為中度殘疾，行走無需幫助，但其他日常生活和活動需要一定幫助；4分表現為重度殘疾，行走及自身護理均需要幫助；5分表現為嚴重殘疾，大小便失禁，需要護理照顧；6分為死亡。對所有患者治療結束后3個月時進行門診隨訪并進行MRS評分，MRS評分結果范圍為0～5分，以MRS評分≤2分為預后良好，≥3分為預后不良。

1.2 主要試劑 TRIzol試劑購買于美國Qiagen公司，miR CURY LNATM Universal cDNA Synthesis Kit、miR CURY LNATM SYBR Green master mix Universal RT均購買于丹麥Exiqon公司；miR-191、miR-18a及U6均由上海生工生物科技有限公司設計并合成。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集與處理 所有研究對象于空腹狀態下采集8 ml外周靜脈血，置于無菌采血管中，靜置28 min，4200 r/min離心8 min，輕取上層血清置入EP管中，分成兩份，一份置于4 ℃冰箱中保存，一份置于-20 ℃冰箱中凍存，待檢。

1.3.2 低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、總膽固醇檢測 從4 ℃冰箱中取出保存的血清樣本，利用羅氏MODULAR.P800全自動生化分析儀對所有研究對象的血清樣本進行低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、總膽固醇水平檢測。

1.3.3 實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)法檢測血清miR-191、miR-18a水平 從-20 ℃冰箱中取出凍存血清樣本，利用TRIzol試劑并按照試劑說明書提取所有血清樣本總RNA，利用Amersham Ultrospec2001檢測所有樣本總RNA純度、濃度，所有樣本總RNA吸光度A260/A280比值均在1.8～2.1范圍之內，表明所有樣本總RNA純度較好，樣本合格；依據逆轉錄試劑盒miR CURY LNATM Universal cDNA Synthesis Kit說明書將總RNA反轉錄成cDNA；按照實時熒光定量PCR試劑盒miR CURY LNATM SYBR Green master mix Universal RT說明書具體操作步驟配制反應體系，并利用MJ Research DNA Engine Option 2 熒光定量PCR儀進行PCR擴增及檢測。其中PCR擴增反應條件：預變性96 ℃ 6 min；變性96 ℃ 20 s、退火71.8 ℃ 60 s，35個循環；最終延伸72.0 ℃ 6 min。miR-191、miR-18a均以U6為內參(見表1)。用2-△△CT相對定量法計算血清中miR-191、miR-18a表達水平。

2 結 果

2.1 臨床資料比較 與健康組相比，腦卒中組患者在性別、年齡、吸煙史、高血壓史、心臟病史、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白及總膽固醇等方面差異無統計學意義(P>0.05);在糖尿病史方面具有統計學意義(P<0.05)(見表2)。

2.2 兩組血清中miR-191、miR-18a表達水平比較 與健康組相比，腦卒中組患者血清中miR-191表達水平明顯升高(P<0.05)，miR-18a表達水平明顯降低(P<0.05)(見表3)。

2.3 ROC評價血清中miR-191、miR-18a表達水平對缺血性腦卒中的診斷價值 ROC曲線分析顯示，血清中miR-191水平對缺血性腦卒中診斷價值的曲線下面積(area under curve，AUC)為0.878(95%CI:0.833,0.922)，截斷值為1.28，其靈敏度、特異度分別為80.5%、83.3%；血清中miR-18a水平對缺血性腦卒中診斷的AUC為0.765(95%CI:0.703,0.826)，截斷值為0.86，其靈敏度、特異度分別為71.2%、71.1%；血清中miR-191、miR-18a聯合對缺血性腦卒中診斷的AUC為0.907(95%CI0.871,0.944)，其靈敏度、特異度分別為90.7%、75.4%(見圖1)。

2.4 兩組預后不同缺血性腦卒中患者血清中miR-191、miR-18a水平及MRS評分比較 與預后良好組相比，預后不良組患者血清miR-191表達水平及MRS評分顯著升高(P<0.05)，miR-18a表達水平顯著降低(P<0.05)(見表4)。

2.5 Logistic回歸分析影響缺血性腦卒中預后的因素 以糖尿病史及缺血性腦卒中患者血清中miR-191、miR-18a表達水平和MRS評分為自變量，以缺血性腦卒中預后為因變量，進行Logistic回歸分析，結果顯示糖尿病史、miR-191、MRS評分是缺血性腦卒中預后的危險因素(P<0.05)，miR-18a是缺血性腦卒中的預后保護因素(P<0.05)(見表5)。

表1 miR-191、miR-18a及內參U6的引物序列

表2 兩組臨床資料比較(例

與健康組比較*P<0.05

組別例數miR-191miR-18a健康組腦卒中組t值P值114118--1.05±0.311.62±0.39?12.29701.02±0.280.76±0.21?8.0190

與健康組比較*P<0.05

表4 兩組預后不同缺血性腦卒中患者血清中

與預后良好組比較*P<0.05

表5 影響缺血性腦卒中預后因素的Logistic回歸分析

圖1 血清中miR-191、miR-18a聯合對缺血性腦卒中的ROC診斷價值

3 討 論

缺血性腦卒中是臨床常見的心腦血管疾病，預后差、病死率高是其特點，嚴重影響患者生存質量，給患者家庭帶來極大生活壓力[8]。因此，尋找能夠早期高效診斷缺血性腦卒中并評估預后指標，對疾病預防控制具有重大臨床意義。

miRNA是存在于機體內的非編碼單鏈RNA，在信號轉導、組織分化、細胞增殖等生物學過程中發揮重要調節作用。功能性miRNA被認為在缺血期間保護神經和突觸的可塑性中起重要作用，在腦損傷[9]、缺血-灌注再損傷[10]、缺血性腦卒中[11]等缺血性疾病或神經系統疾病中表達失調，可作為相應疾病診斷、病情及預后評估指標。Wu等[12]研究發現miR-191可直接作用于胱硫醚-β-合酶，從而促進腎小管上皮細胞凋亡和腎缺血再灌注損傷。miR-191在創傷性腦損傷中表達異常，可作為腦損傷診斷、預后、治療指標[13]。miR-191a-5p是miR-191其中一員，Zhou等[14]發現腦缺血大鼠經電針治療后，大鼠原代神經元和皮質中miR-191a-5p表達下調，可增加細胞活力、減少細胞凋亡及梗死體積、改善神經學評分，過表達miR-191a-5p可加劇神經元損傷，并逆轉缺血/再灌注損傷后電針治療的神經保護作用。以上研究表明，miR-191在缺血性或神經系統受損疾病中發揮一定作用。本研究中腦卒中組患者血清中miR-191表達水平明顯高于健康組，提示血清中miR-191表達水平可能影響缺血性腦卒中的發病進展。Yang等[15]研究顯示三七總皂苷通過上調miR-18a水平，調節血管生成，進而減輕心肌缺血的癥狀。miR-18a在2型糖尿病患者單個核細胞中表達異常，其可能與2型糖尿病發病相關[16]。此外，羅建華等[5]發現miR-18a老年急性心肌梗死患者血清表達失調，對于診斷、評估老年急性心肌梗死病情具有參考價值。以上研究表明，miR-18a可能對血管異常或其所致的梗死疾病具有一定影響。本研究顯示，miR-18a表達水平明顯低于健康組，提示miR-18a在缺血性腦卒中發展進程中起到一定作用。

隨著頭部CT、MRI掃描、多普勒檢查技術在醫學上的應用，缺血性腦卒中的檢出率大幅提高，但檢查所需費用高昂，對患者及時治療有一定影響，因此尋找低價且可早期能夠高效診斷、評估病情的臨床指標對提高救助患者具有重大意義。血清中miR-191、miR-18a對缺血性腦卒中診斷AUC為0.878、0.765，當血清miR-191相對表達量高于1.28或血清miR-18a相對表達量低于0.86時，缺血性腦卒中患病幾率較高，提示miR-191、miR-18a對缺血性腦卒中診斷具有一定診斷效能；血清miR-191、miR-18a聯合診斷缺血性腦卒中的AUC為0.907，靈敏度、特異度分別為90.7%、75.4%，提示兩者聯合可有效提高缺血性腦卒中的診斷效能，有助于更準確的診斷出缺血性腦卒中。

此外MRS評分與缺血性腦卒中預后情況密切相關，故對患者進行MRS評分。本研究顯示預后不良組患者血清miR-191表達水平,MRS評分顯著高于預后良好組，miR-18a表達水平顯著低于預后良好組，提示血清miR-191、miR-18a表達水平及MRS評分對患者預后情況具有較好的臨床參考價值。進一步分析發現糖尿病史、miR-191、MRS評分是影響缺血性腦卒中預后的危險因素，miR-18a是影響缺血性腦卒中預后的保護因素，提示血清miR-191、miR-18a表達失調，患有糖尿病史，MRS評分過高均可能使缺血性腦卒中的患病風險增加，及早監控血清miR-191、miR-18a水平，并對治療后的患者進行MRS評分，有助于診斷并及時控制缺血性腦卒中的發病進展。

綜上所述，缺血性腦卒中血清miR-191表達上調，miR-18a表達下調，miR-191、miR-18a均可能參與缺血性腦卒中的發生進展過程，兩者聯合可有效提高診斷價值，且對預后評估具有一定價值。