從Nogo-A-NgR信號通路探討MCAO大鼠皮脊髓束重塑的啟動及復健片干預機制

劉 維, 英振昊, 張國麗, 劉 偉

由于缺血性腦卒中后的神經功能修復機制尚未明確，導致其機制性研究成為了近年來現代醫學亟待解決的問題之一。皮質脊髓束(Corticospinal tract，CST)重塑對其有著一定的促進作用。復健片對卒中病后受損神經功能的修復有顯著地促進作用[1]，可以促進皮質脊髓束重塑[2,3]。腦卒中發生后，失神經支配側的脊髓灰質部位出現CST重塑，且其重塑對癱瘓肢體運動功能的恢復有一定促進作用[4]，這高度提示了局灶性腦梗死后脊髓可能參與了缺損神經功能的修復。研究表明，Nogo-A與其受體NgR結合可抑制軸突再生[5～7]，而生長相關蛋白43(GAP-43)是軸突生長和可塑性的示蹤因子。故本研究采納大腦中動脈閉塞(MACO)模型，分析復健片干預下腦梗死后頸髓GAP-43表達以及Nogo-A-NgR信號通路的表達變化，以期揭示局灶性腦梗死后CST重塑的可能啟動機制及藥物干預機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠12周齡，55只，體重維持在250～300 g，實驗大鼠均購自于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，其合格證號為：SCXK(魯)20140007。大鼠實驗經山東中醫藥大學實驗室動物管理和使用委員會批準同意。

1.2 主要儀器 腦立體定位儀(第二軍醫大學，上海)，微量天平(Mono Bloc AB204-S)，臺式恒溫振蕩器(上海躍進醫療器械THZ-92B),超聲波細胞粉碎機(西安德派公司),垂直板蛋白電泳儀(上海天能公司),化學發光多色熒光成像系統(法國Vilber Fusion FX7),聚合酶鏈式反應(PCR)儀(美國安捷倫MX3000P實時熒光定量PCR儀),偏光熒光顯微鏡(日本尼康公司)。

1.3 主要試劑 神經示蹤劑生物素葡聚糖胺(BDA)試劑盒購于Molecular Probes公司，大鼠環磷酸腺苷(cAMP)酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒購于武漢基因美科技有限公司，lightCyler480 SYBR Green I Master、lightCyler480 Multiwell plate 96試劑盒均購于Roche公司，反轉錄試劑盒購于Takara公司，即用型正常山羊血清購于武漢博士德生物工程有限公司，兔抗大鼠GAP-43單抗購于Abcam公司，羊抗兔IgA二抗、Nogo-A抗體、NgR抗體購于北京博奧森生物技術有限公司，羊抗兔熒光二抗購于Invitrogen公司。

2 實驗方法

2.1 動物模型制備及分組 按Tamura[8]改良法對造模組制備右側近端大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。待大鼠麻醉醒后，對大鼠進行測試，其中造模成功的大鼠須符合以下標準(至少符合一項):(1)對大鼠左側肢體對疼痛刺激無收縮反應；(2)大鼠在平面上自由爬行會向患側轉圈或傾倒；(3)大鼠被提尾懸掛空中時左上肢屈曲、內收。隨機選取45只造模成功的MCAO大鼠作為未BDA組(術后1 w和術后2 w組)和BDA組(術后2 w組)，其中未BDA組包括藥物組和模型組各8只;BDA組包括藥物組和模型組各5只。另隨機選取13只健康大鼠，除不閉塞大腦中動脈，其它操作與造模組相同，其中8只作為未BDA組的假手術組;5只作為BDA組的假手術組。

2.2 給藥方法 每組大鼠同時于術后1 w末進行灌胃，藥物組大鼠給予復健片濃縮液(由山東中醫藥大學藥劑教研室制作)，按照5.9 ml/kg劑量灌胃，其余大鼠灌胃等量的生理鹽水，一日一次。自由飲水、飲食。復健片濃縮液生產批號：20161012，其中生藥濃度為1.53 g/ml。

2.3 BWT評分 分別于MCAO術后1 w末、2 w末，采用Feeney等[9]走橫木試驗(BWT)對各組大鼠進行運動功能評分并記錄(2人同時觀測，其中1人不知分組情況)。

2.4 BDA(biotin dextran amine BDA)順行示蹤 術后1 w末對BDA組的3組大鼠的左側大腦皮質注射生物素葡聚糖胺(Biotin dextran amine，BDA)。將大鼠以4%水合氯醛(0.7 ml/100 g體重)進行腹腔注射麻醉，待麻醉成功后用剃毛器對頭頂部皮膚備皮，將大鼠固定在腦立體定位儀上，切開頭皮，剝離骨膜，充分暴露前囟及左側感覺運動區。注射點為：以前囟為標準，分別于前囟中點后1 mm、2 mm;左側旁開3.5 mm、4.5 mm處，即(-1 mm，3.5 mm)、(-1 mm,4.5 mm)、(-2 mm，3.5 mm)、(-2 mm，4.5 mm)4個部位注射BDA。用微型電鉆鉆孔至硬腦膜，10 μl微量注射器注射，每個注射點注入0.2 μl 10%BDA溶液，注射深度為皮質下1.5 mm～1.7 mm。注射結束后，將針頭停留2 min，拔出針頭，將腦表面用薄層明膠海綿覆蓋，進行頭皮縫合。

2.5 取材及指標檢測 將各組大鼠在相應時間點麻醉處死，并取出大腦和頸髓(C4-C6)，頸髓長度約1.5 cm。其中用于TTC染色的大腦置于-20 ℃冰箱，備用；用于BDA染色顯影的頸髓組織置于4%多聚甲醛固定，備用；用于Western blot、免疫熒光、PT-PCR法檢測的頸髓組織置于液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱，備用。

2.5.1 免疫組織化學方法觀測頸髓BDA染色顯影 BDA注射1 w后將大鼠麻醉處死，取出頸髓組織 C4-C6節段，并放于4%多聚甲醛中，過夜固定，然后放于10%、20%、30%蔗糖中剃度脫水。待組織塊沉入容器底后，取出，OCT包埋，用冰凍切片機對包埋后的頸髓組織作連續冠狀切片，每片厚約40 μm。組織切片先在0.5%H2O2中反應15 min；TBS漂洗3次，每次5 min；將切片于含0.3%Trition X-100的TBS(pH7.5)中，4 ℃孵育6 h；TBS漂洗3次，每次5 min；將切片于辣根-HRP(濃度為0.8 μg/ml)中，常溫過夜。TBS漂洗3次，每次5 min；將切片于DAB溶液中(濃度為0.05%，內含0.5 mol/ml pH7.6 Tris-HCl，0.1%H2O2)顯色15 min；TBS終止反應。裱片，風干；75%乙醇中脫水2 min，95%、95%、100%、100%乙醇中各脫水5 min，二甲苯1、二甲苯2中各脫水5 min；脫水完畢后用中性樹膠封片，于普通光鏡下觀察BDA陽性的皮質脊髓束的走行分布，并采集圖像。

2.5.2 熒光定量PCR檢測大鼠左側頸髓(C4-C6)GAP-43 mRNA表達 將頸髓組織取出后立即置于液氮中研磨，采用TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific,Inc.)抽提RNA，并按照Takara逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄操作。將每組的cDNA取出一部分，等比例混勻，稀釋，此即為熒光定量PCR的模板。其他步驟按照Roche公司SYBR Green試劑盒說明書操作。

2.5.3 Western blot檢測大鼠頸髓(C4-C6)GAP-43蛋白表達 取出頸髓，對組織進行研磨，并加入裂解液，對研磨后的組織勻漿進行超聲粉碎20 min，離心，取上清液，進行蛋白濃度測定；灌膠；進行蛋白上樣，并加入預染的蛋白Marker，進行10% SDS-PAGE電泳。電泳結束后轉移至PVDF膜上；用5%脫脂奶粉封閉1 h，室溫；加入一抗(GAP-43按1∶20000稀釋)，室溫環境中孵育2 h，置于4 ℃冰箱，孵育，過夜；復溫1 h，條帶用TBST漂洗4次，每次8 min；加入二抗(羊抗兔IgG，1∶3000稀釋)，室溫，孵育1 h；TBST漂洗4次，每次8 min；TBS漂洗兩次，每次5 min。DAB顯色反應后，使用FUsion軟件拍照，并用Bio1D分析每個條帶的灰度值，以樣本灰度值/β-actin灰度值得到的比值作為最終結果。

2.5.4 免疫熒光法檢測大鼠頸髓水平Nogo-A、NgR蛋白表達變化 將各組頸髓組織取出并包埋，冰凍切片，每片厚6 μm；將切片置于丙酮中浸泡15 min；0.01 mmol/L PBS漂洗3次，每次5 min，切片置于濕盒；滴加10%山羊血清(即用型山羊血清，0.01 mmol/L PBS配制)溶液室溫孵育1 h；將多余的封閉液甩掉，將切片置于濕盒，滴加含0.01 mmol/L PBS的一抗-兔單克隆抗體至Nogo-A(1∶200)；兔單克隆抗體至NgR(1∶200);置于4 ℃冰箱孵育過夜，陰性對照采用0.01 mmol/L PBS代替一抗；次日將濕盒于室溫下復溫30 min;0.01 mmol/L PBS漂洗3次，每次5 min，切片置于濕盒；滴加Alexa 594偶聯驢抗小鼠IgG(H+L)抗體(1∶400，由抗體稀釋液稀釋)，室溫避光孵育2 h；0.01 mmol/L PBS漂洗3次，每次5 min，切片置于濕盒；滴加DAPI溶液(1∶1000，雙蒸水稀釋)室溫孵育20 min；0.01 mmol/L PBS漂洗3次，每次5 min，切片置于濕盒；滴加少量50%甘油蓋玻片封片；熒光顯微鏡觀察，并拍照。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠不同時間點BWT評分 術后1 w、2 w末，較之假手術組，模型組和藥物組評分均低(P<0.05)；且藥物組于術后2 w末表達高于模型組(P<0.05)(見表1)。

3.2 梗死對側及梗死側頸髓CST神經纖維數 在梗死對側的頸髓后索可見排列整齊的致密的梭形纖維束，梗死側頸髓后索可見少量的條索狀的BDA陽性纖維(見圖1)。各組大鼠術后2 w末梗死對側頸髓BDA陽性CST纖維總計數差異無統計學意義(P>0.05)；但梗死側頸髓后索中模型組和藥物組BDA陽性纖維總數明顯多于假手術組(P<0.05)(見表2)。

3.3 各組大鼠術后1 w、2 w末頸髓GAP-43 mRNA及蛋白表達 術后1 w末，模型組與假手術組頸髓GAP-43蛋白、mRNA表達均無統計學差異(P>0.05)；術后2 w末，藥物組和模型組大鼠頸髓水平 GAP-43蛋白和mRNA表達較之假術組均有明顯提升(P<0.05)(見圖2、圖3)。

3.4 各組大鼠術后1 w、2 w末頸髓Nogo-A、NgR蛋白表達 術后2 w末模型組和藥物組大鼠梗死側頸髓水平的Nogo-A、NgR陽性蛋白數量均比同期的假手術組表達減少，其中藥物組表達低于模型組(見圖4)。

表1 各組大鼠BWT評分情況

與同期假手術相比▲P>0.05,無統計學意義，*P﹤0.05;與同期模型組相比★P﹤0.05

表2 梗死對側及梗死側皮質脊髓束BDA陽性纖維總數

與同期假手術組比較*P>0.05，無統計學意義,#P<0.05；與模型組比較△P<0.05

圖1 頸髓平面后索區域BDA 陽性CST纖維(200倍鏡)。箭頭所示為由梗死對側CST跨越至梗死側脊髓后索的BDA陽性纖維(A:術后2 w假手術組；B:術后2 w模型組；C：術后2 w藥物組)

圖2 各組大鼠術后1、2 w末頸髓(C4-C6)GAP-43 mRNA表達。與同期的假手術組相比較*P>0.05,無統計學意義,#P<0.05；與同期的模型組相比較▲P>0.05,無統計學意義(1 w:術后1 w末;2 w:術后2 w末)

圖3 各組大鼠術后1 w、2 w末頸髓(C4-C6)GAP-43蛋白灰度比值。與同期的假手術組相比較*P>0.05,無統計學意義,#P<0.05；與同期的模型組相比較▲P>0.05,無統計學意義(1 w:術后1 w末;2 w:術后2 w末。S：假手術組;M：模型組;A：藥物組)

圖4 術后2 w末大鼠左側頸髓Nogo-A、NgR蛋白表達。Alexa Fluor488標記的NgR蛋白呈綠色熒光,DAPI 標記細胞核呈藍色熒光×200(S1:術后1 w假手術組;M1:術后1 w模型組;S2:術后2 w假手術組;M2:術后2 w模型組;A2：術后2 w藥物組)

4 討 論

4.1 西醫對缺血性卒中及CST重塑的認識 缺血性卒中，又稱腦梗死，該病是臨床常見的缺血性腦血管病，常見于老年人[10]。目前，絕大多數卒中患者沒有有效的治療方法，部分原因是大腦修復和神經元可塑性的機制以及它們與行為和功能恢復的關系還不完全清楚。研究表明CST重塑能促進偏癱肢體的運動功能恢復[11]。腦卒中發生后，發生在脊髓失神經側的CST重塑可促進缺損運動功能的恢復[12]。這提示，局灶性腦梗死后脊髓可能參與了神經功能修復。

BDA是一種神經纖維示蹤劑，可以良好地評價CST的微觀結構。通過BDA神經順行示蹤技術，并經過BDA染色顯影后，可觀察到約99%的CST在錐體交叉后走行于對側的脊髓白質后索[13]。故本研究使用BDA順行追蹤健側CST，發現各組大鼠健側頸髓后索均可見致密的梭形纖維束，其CST纖維總計數于各組大鼠之間并無差異，說明各組大鼠未發生變異，在此前提下，比較梗死側頸髓BDA陽性CST纖維總計數更具有科學性。正常情況下，少數的頸髓CST會交叉至對側進行雙側支配，本研究亦發現，術后2 w末，假手術組大鼠的梗死側頸髓后索中，可見少量的條索狀的BDA陽性CST纖維。而模型組和藥物組大鼠梗死側頸髓后索中BDA陽性CST纖維總數明顯多于假手術組。而前面已述及各組大鼠梗死對側的CST纖維總數并未發生明顯變化，故模型組、藥物組大鼠梗死側明顯增多的CST陽性纖維，極可能是腦梗死后對側CST纖維芽生并跨越至梗死側的新生纖維。

GAP-43是一種神經特異性的軸突膜蛋白，參與神經細胞外生長及軸突發育和神經細胞再生，主要表達于軸突的生長錐末端。在神經元的發育及再生過程中，GAP-43可伴隨著軸突的生長大量合成，可作為軸突生長的示蹤因子。成熟哺乳動物中，GAP-43的表達往往較低，其表達的升高則意味著軸突的再生長。本實驗結果表明，術后2 w末，藥物組和模型組大鼠梗死側頸髓GAP-43蛋白表達較之假手術組均有明顯提升，這一結果與BDA染色顯影結果相吻合，這表明，腦梗死后，健側CST可發生側支發芽，并跨越中線至對側。但我們發現術后1 w末，模型組與假手術組梗死側頸髓GAP-43蛋白表達并無明顯差異，這說明術后1 w末梗死側頸髓水平CST重塑可能尚未出現，這高度提示局灶性腦梗死發生后，健側大腦皮質發出的CST中線跨越啟動時間可能發生在術后1 w末至術后2 w末之間，故觀測術后1 w末、2 w末頸髓層面重要神經生長相關因子的表達，可有助于揭示皮質脊髓束重塑的啟動機制。

Nogo-A是一種髓磷脂蛋白，腦梗死后少突膠質細胞過度分泌的Nogo-A是抑制軸突生長的主要因素[14]。Lindau等[15]研究證實，缺血性腦梗死后，Nogo-A蛋白可抑制CST結構及功能的恢復，但通過抗Nogo-A治療后，跨越中線交叉至去神經脊髓半側的纖維增加至之前的2～3倍，有效地促進了神經功能的恢復。

NgR是Nogo-A的受體，一種位于神經元表面的糖基醇磷脂結合蛋白。研究證實NgR的拮抗劑亦有助于軸突再生[16]。有研究證實，使用NgR1的拮抗劑治療后，可通過抑制缺血腦中的細胞凋亡，減少大腦梗死面積，來保護大腦免缺血/再灌注損傷，從而改善缺血誘導的神經缺損情況[17,18]。另有研究表明，Nogo-A與其受體NGR結合后，通過其功能部件激活胞內下游靶基因，抑制軸突再生[19～21]。這些研究結果均說明Nogo-A與其受體NgR不論作為獨立因子發生作用還是結合后共同作用，均可對軸突的生長產生一定的抑制作用。

4.2 中醫對缺血性卒中的認識 缺血性卒中大多數屬中醫“中風”范疇，中醫認為其病位在腦，精虧髓空是中風病的病機基礎。“諸髓者，皆屬于腦”，腦髓的充盈與否決定了機體感覺運動功能是否正常。“腎藏精，精生髓”，故腎中精氣充盈，腦髓得以充養；腎精虧虛，不能上承于腦，腦髓無以充養，大腦調控機體運動功能失常，可發為中風。因此，臨床對卒中病后期恢復的治療應重視益精填髓法的運用。

本研究選用的復健片即為益精填髓之方藥，由制何首烏、桑寄生、淫羊藿、海馬、草決明組成。方中何首烏善補肝腎、益精血，填真陰，為君藥；淫羊藿性溫潤，溫補腎陽的同時又無傷髓耗髓之弊，與制何首烏同用以達陰陽雙補之功；桑寄生補肝腎、益精氣，同時又可豁痰熄風，平降氣血；草決明益腎水、清肝導滯。此外，方中海馬，乃為血肉有情之品，溫陽補腎，調氣活血，以達陽中求陰之功。由此可見，由諸多填髓中藥組成的復健片可綜合調理髓的功能，促進卒中病的后期恢復。研究表明，復健片對中風病后受損神經功能的修復有著顯著地促進作用[1]，可以促進皮質脊髓束重塑[2,3]。而且，復健片對未損傷側大腦的下調腦區有一定的激活作用[22]，還可以上調未損傷側大腦GAP-43的表達[23]。

4.3 結果與結論 本研究發現，術后1 w、2 w末，模型組梗死側頸髓的Nogo-A和NgR表達低于同期的假手術組，其中藥物組低于同期模型組。而前面已證實，術后2 w末模型組和藥物組梗死側頸髓水平GAP-43蛋白的表達較同期假手術組顯著增強，其運動功能評分亦均高于假手術組。再者，我們的前期研究已證實，術后1 w、2 w末，模型組和藥物組大鼠梗死側頸髓層面的cAMP、PKA-C表達均高于同期的假手術組，且藥物組表達高于同期模型組[1]。故結合本文的相關研究結果，提示局灶性腦梗死后，支配前肢運動的頸髓由于失神經支配而短時間激活cAMP-PKA通路，抑制Nogo-A-NgR信號通路的傳導，從而有助于健側大腦皮質發出的皮質脊髓束重新跨越中線，自發性地完成一定程度的皮質脊髓束重塑；而復健片可以進一步上調腦梗死后頸髓水平cAMP、PKA-C含量，抑制Nogo-A、NgR表達，最大程度地實現功能性的CST重塑，從而促進缺損神經功能的恢復，這可能是腦梗死后CST重塑的啟動機制及復健片干預機制。

本研究突破了以腦為核心的腦梗死后神經功能恢復機制的研究思路，從形態學、分子學和行為學上動態觀測了復健片干預下局灶性腦梗死后頸髓層面神經纖維重塑狀態變化，為系統地揭示局灶性腦梗死的神經修復機制研究提供了堅實的實驗基礎。但本研究亦存在不足之處：(1)樣本量過少;(2)本研究中涉及的各個因子之間是如何相互影響的，其中間的共同因子尚未涉及，完整的神經通路有待深入研究。