脂聯素在腦梗死不同亞型病程中的變化規律研究

張向暉, 周官恩

脂肪組織可分泌有活性的化合物[1]。脂聯素是一種30 kDa的蛋白質，主要由脂肪細胞合成，也由骨骼肌、內皮細胞和心肌細胞產生[2]。脂聯素在血液中以3種分子形式在高水平循環：低分子量(LMW)三聚體形式、中分子量(medium molecular weight，MMW)六聚體形式和高分子量(high molecular weight，HMW)多聚體。脂聯素通過直接作用于心臟和血管中的組分細胞來介導對心血管系統的有益作用[3,4]。脂聯素與中心性肥胖和腦血管疾病有關[5]。冠狀動脈疾病患者以及心力衰竭患者血漿總脂聯素(total adiponectin，tAPN)水平降低[6]。脂聯素是一種在體內有保護作用的脂肪因子，例如,抗動脈粥樣硬化和抗炎癥特性[7]。它還增加胰島素敏感性，并維持能量平衡、葡萄糖代謝和脂質代謝，這與缺血性卒中的發生率密切相關[8]。脂聯素可抑制腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)粘附分子的表達和單核細胞粘附于內皮細胞，降低清道夫受體的表達[9]。脂聯素可抑制受損的血管內膜增生，使平滑肌細胞增殖和遷移，以減少斑塊大小[10]。脂聯素是一種心血管保護分子，與野生型對照相比，脂聯素敲除小鼠有更大的梗死面積、更大的心肌細胞凋亡和增加的TNF-α表達[11]。本研究探究不同分子量脂聯素在腦梗死不同亞型病程中的變化及相關性。

1 材料和方法

1.1 一般資料 選取2017年8月-2019年2月來我院檢查確診為腦梗死患者182例為病例組，其中男性患者106例(58.24%)，女性患者76例(41.75%)。患者平均年齡為(56.34±6.78)。其中腦梗死亞型大動脈粥樣硬化性卒中68例(37.36%)，小動脈閉塞性卒中59例(32.41%)，心源性腦栓塞55例(30.21%)；選取來我院進行健康體檢的115例非腦梗死患者作為對照組進行實驗。對照組之前無過心腦血管疾病和腦部相關手術，無任何先前的神經系統疾病，在磁共振成像上無明顯的結構異常。病例組和對照組在性別、體重指數和年齡上無差異性統計。入選標準：性別不限；首次腦梗死發病，時間為24 h內入選；病前無服用過抗腦梗死類藥物。排除標準：血液系統疾病；腦部無其他手術史；嚴重心臟病患者；嚴重糖尿病史；腦腫瘤、腦血管畸形；精神疾病患者。

1.2 方法

1.2.1 血液樣本采集 對于樣本的采集為分批進行，共計采集4次。在第1天、第4天、第10天和第14天晚上10點后禁止如食，早上進行空腹靜脈采血每次抽取3 ml，將來自靜脈的血液樣品收集在含有EDTA(1.6 mg/ml血液)和抑肽酶蛋白酶抑制劑(50 KIU/ml血液)的無菌管中(BD公司，美國)。將血液樣本放入3000轉/分離心機內離心10 min用于血清和血細胞的分離，-70 ℃儲存。

1.2.2 蛋白質免疫印跡 通過免疫印跡測定血清液中各分子量脂聯素蛋白表達。將血清液置于含有蛋白酶抑制劑的冰冷PBS裂解緩沖液(pH7.4)中，勻漿并在冰上置45 min，離心后-80 ℃儲存。通過SDS-PAGE電泳分離蛋白質(30 μg/泳道)并轉移至硝酸纖維素膜(伯樂生命醫學產品有限公司，上海)進行免疫印跡。然后將膜與兔多克隆抗tAPN、HMW脂聯素、MMW脂聯素和LMW脂聯素(1∶200；賽默飛世爾科技有限公司，上海)孵育。在室溫下1 h，洗滌，并與PBS-T中的第二HRP綴合的山羊抗兔和山羊抗小鼠抗體(1∶20,000；賽默飛世爾科技有限公司，上海)孵育1 h。單克隆抗β-肌動蛋白抗體作為內部對照重新探測，通過光密度測定含量。

1.2.3 血清脂聯素含量測定 將血清樣本稀釋后(每孔50 μl)加入到96孔多層板(國藥集團化學試劑有限公司，上海)中,并在37 ℃下孵育1 h。用200 μl BlockAce(賽默飛世爾科技有限公司，上海)在37 ℃下封閉每個孔1 h。然后每孔使用250 μl PBST洗滌孔3次，并向每個孔中加入50 μl稀釋的抗體。將板在37 ℃下孵育1 h。然后將板用每孔250 μl PBST洗滌3次，與每孔50 μl稀釋的HRP-綴合的兔抗山羊IgG或HRP-綴合的山羊抗小鼠IgG一起在37 ℃溫育1 h。然后將板每次用250 μl PBST洗滌5次。向每個孔中加入50 μl TMB+底物色原(上海玉博生物科技有限公司，上海)并在室溫下溫育3 min。通過加入50 μl 1 M H2SO4終止顯色。使用Molecular Devices SPECTRA max PLUS 384(美谷分子儀器有限公司，美國)在450 nm的波長下測量吸光度。

2 結 果

2.1 研究對象的分組 腦梗死患者182例為腦梗死組(n=182)，其中男性患者106例(58.24%)，女性患者76例(41.75%),患者平均年齡為(60.34±7.78)。其中腦梗死亞型大動脈粥樣硬化性卒中68例(n=68，37.36%);小動脈閉塞性卒中59例(n=59，32.41%);心源性腦栓塞55(n=55，30.21%)。研究對象中在冠心病史、吸煙史、高血壓史上腦梗死組較對照組比例相對升高(P<0.05)。對照組與腦梗死組在年齡、體重指數和男女比例上比較無差異性統計(P>0.05)(見表1)。

2.2 Logistic回歸分析不同分子量脂聯素在不同TOAST分型病程中的變化 冠心病史、糖尿病史、吸煙史和高血壓史均與不同分子量脂聯素在不同TOAST分型病程中的變化相關(P<0.05)；而年齡和性別差異無統計學意義(P>0.05)(見表2)。

2.3 脂聯素蛋白水平測定 與對照組相比，腦梗死組中tAPN蛋白水平降低(P<0.05)，主要表現在HMW脂聯素蛋白水平下降(P<0.05);而MMW脂聯素蛋白水平增加(P<0.05)，LMW脂聯素蛋白水平不變(P>0.05)(見圖1、表3)。

2.4 tAPN在腦梗死亞型中的含量測定 與對照組相比，在第1天、第4天、第10天、第15天，大動脈硬化組和心源性腦栓組tAPN水平均降低(P<0.05)；而小動脈閉塞組tAPN水平在病程中呈先下降后回升趨勢，在病程第4天至第10天降低(P<0.05)(見圖2、表4)。

2.5 HMW脂聯素在腦梗死亞型中的含量測定 與對照組相比，在第1天、第4天、第10天、第15天，大動脈硬化組HMW脂聯素水平降低(P<0.05)；而小動脈閉塞組HMW脂聯素水平在病程中呈先下降后回升趨勢，在病程第4天至第10天降低(P<0.05)，心源性腦栓組HMW脂聯素水平在病程中呈先下降后穩定趨勢(P<0.05)(見表5)。

2.6 MMW脂聯素在腦梗死亞型中的含量測定 與對照組相比，MMW脂聯素水平在病程中呈先下降后回升趨勢，在第4天內大動脈硬化組、小動脈閉塞組及心源性腦栓組MMW脂聯素水平升高(P<0.05)；在第10天內大動脈硬化組、小動脈閉塞組及心源性腦栓組MMW脂聯素水平無差異(P>0.05)；在第15天內大動脈硬化組、小動脈閉塞組及心源性腦栓組MMW脂聯素水平均降低(P<0.05)(見表6)。

2.7 LMW脂聯素在腦梗死亞型中的含量測定 與對照組相比，在第1天、第4天、第10天、第15天，大動脈硬化組、小動脈閉塞組及心源性腦栓組LMW脂聯素水平相當，與對照組相比無差異性統計(P>0.05)(見表7)。

表1 對照組與腦梗死組患者一般資料對比

表2 Logistic回歸分析不同分子量脂聯素在不同TOAST分型病程中的變化

表3 對照組與腦梗死組患者脂聯素含量比較

表4 對照組與腦梗死組患者tAPN含量比較

表5 對照組與腦梗死組患者HMW脂聯素含量比較

表6 對照組與腦梗死組患者MMW脂聯素含量比較

表7 對照組與腦梗死組患者LMW脂聯素含量比較

圖1 對照組與腦梗死組患者脂聯素蛋白水平檢測

圖2 對照組與腦梗死組患者tAPN含量比較

3 討 論

HMW脂聯素是預測腦梗死程度的有用標記。較低水平的HMW脂聯素與冠狀動脈斑塊的嚴重程度和脆弱特征有關[12]。我們研究中腦梗死血清tAPN和HMW脂聯素水平相對較低。脂聯素可通過其特異性受體調節葡萄糖和脂質代謝，從而發揮其抗炎和抗動脈粥樣硬化作用。

脂聯素與許多病理過程有關，并且其合成受到不同方式的調節。作為脂聯素的活性形式，HMW脂聯素與腦梗死嚴重程度呈負相關。根據Ambroziak等的研究，血管造影冠狀動脈粥樣硬化嚴重程度和冠狀動脈高危斑塊主要歸因于HMW-tAPN比率降低[13]。與對照組相比，HMW脂聯素、HMW-tAPN比率與腦梗死嚴重程度間的負相關性強于tAPN和腦梗死嚴重程度間的負相關。腦梗死組中tAPN蛋白水平主要表現為HMW脂聯素蛋白水平下降，而MMW脂聯素蛋白水平增加，LMW脂聯素蛋白水平不變。脂肪組織在腦血管疾病過程中會膨脹，變得缺氧并且功能失調。脂肪細胞大小的變化和包括脂聯素在內的保護性蛋白質的產生的減少有利于有害的脂肪細胞因子，例如瘦蛋白、抵抗素或IL-6心外膜脂肪中較低的脂聯素濃度與冠狀動脈疾病患者炎癥分子水平升高有關[14]。這些數據可能解釋我們對血液中脂聯素減少的發現。脂肪組織可作為支持和機械因素，可能是細胞因子和脂肪因子的血管分泌和旁分泌來源。

HMW脂聯素是這種蛋白質中最活躍的形式，對于冠狀動脈疾病程度來說，其比tAPN更有效和敏感的生物標志物[15]。Song已經證實在小鼠心肌缺血-再灌注損傷后24 h血漿HMW脂聯素水平降低[16]。我們的結果表明，與對照組相比，在第1天、第4天、第10天、第15天，大動脈硬化組HMW脂聯素水平均降低;而小動脈閉塞組HMW脂聯素水平在病程中呈先下降后回升趨勢，在病程第4天至第10天降低，心源性腦栓組HMW脂聯素水平在病程中呈先下降后穩定趨勢。雖然補充外源性脂聯素可有效減輕動物的腦血管疾病，但仍然難以將脂聯素用作人體內的治療劑。(1)脂聯素的高循環水平是其有益效果所必需的；(2)脂聯素活性需要廣泛的翻譯后修飾；(3)脂聯素的半衰期相對較短。我們的結果顯示腦梗死患者血清脂聯素水平增加。這種作用可能是由心肌細胞局部產生脂聯素或從血漿和心臟脂肪組織轉運引起的。

綜上所述，本研究表明tAPN、HMW與腦梗死密切相關，tAPN、HMW是比MMW和LMW更有效的腦梗死風險的生物標志物，有重要臨床價值。