單一延長應激對Wistar大鼠海馬Calcineurin表達的影響

姜 淼，王越甲，安秋霖，楊濟菲，馬欣桐，李思慧，謝菊華

創傷后應激障礙(Posttraumatic stress disorder，PTSD)是經歷或目睹嚴重威脅生命安全的創傷事件后出現的精神疾病[1,2]。這些創傷事件主要包括戰爭、地震海嘯等自然災害、性暴力等，同時嚴重軀體疾病如過敏性休克、截肢、尿毒癥、致死性惡性腫瘤等也可導致PTSD[3]，據報道約有9.6%的乳腺癌患者可發展為PTSD，并嚴重影響患者的治療及康復[4]。但至今為止，PTSD發病機制尚不清楚。Calcineurin(CaN)是大腦內廣泛存在的、由催化亞基A(CaN A)和調節亞基B(CaN B)構成的四聚體蛋白磷酸酶[5]，參與了許多疾病如阿爾茨海默病、抑郁等的發生發展，在恐懼消退、神經元結構和興奮性調節上發揮了重要作用[6,7]。本研究擬采用單一延長應激暴露建立PTSD動物模型，以觀察CaN在PTSD致海馬損傷中的表達改變，為PTSD發病機制研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康成年雄性Wistar大鼠(n=30)，體重180～210 g，由遼寧省長生生物有限公司提供。將大鼠隨機分為正常對照組(Control組，n=15)、單一延長暴露組(SPS組，n=15)。適應性喂養7 d后SPS組大鼠給予如下[8,9]應激暴露：禁錮大鼠2 h；強迫游泳20 min；休息15 min后乙醚麻醉1～3 min致深度昏迷。隨后分籠常規飼養至14 d后取材進行后續試驗。

1.2 方 法

1.2.1 ELISA檢測海馬組織CaN 水平 各組大鼠冰上快速剝離海馬后，剪碎勻漿，1000 g/min離心取上清。依據ELISA試劑盒(購自上海酶聯生物有限公司)說明書進行后續操作，具體步驟如下：(1)標準品、待測樣品各取50 μl加入96孔板孔隙內;(2)各孔內加入生物素標記的抗體(各50 μl)，震蕩混勻后37 ℃孵育1.5 h;(3)甩去反應孔內液體，加入洗滌液，震蕩30 s，甩去洗滌液，用濾紙拍干。重復操作3次;(4)每孔加入親和鏈酶素-HRP，37 ℃孵育30 min;(5)按上述洗板后，加入50 μl終止液;(6)立即450 nm波長處測定各反應孔OD值，并換算出待測樣品濃度。

1.2.2 Western blot檢測CaN蛋白表達 取材時剝離海馬組織，根據海馬重量按100 g∶0.3 ml加入RIPA 裂解液，超聲粉碎后12000 r/min、4 ℃離心后取上清。依據BCA蛋白定量試劑盒(購自北京鼎國)說明書檢測蛋白濃度。各組分別取50 μg樣品蛋白于8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，電泳恒壓200 mA轉膜1 h，5%牛胚血清常溫封閉1.5 h，隨后加入一抗4 ℃過夜(CaN Aα：ABclonal公司，1∶500稀釋；GAPDH：北京中杉金橋公司，1∶1000稀釋)。TBST洗膜10 min×3次后加入HRP標記的二抗腸胃孵育1.5 h。再次TBST洗膜10 min×3次后ECL發光顯影。對獲得的條帶經Image J軟件分析，對各組灰度值CaN Aα/GAPDH的比值進行數據分析。

1.2.3 免疫組化檢測CaN蛋白分布 采用0.4%戊巴比妥鈉對兩組大鼠進行腹腔麻醉。麻醉成功后暴露心臟,剪開右心耳，用生理鹽水灌流，直至流出液無色；隨后用4%組織固定液灌流至大鼠肝臟發硬。取大鼠腦組織，并浸泡至固定液中6 h后采取石蠟包埋、切片待用。切片常規脫蠟水化后用30%H2O2(1份)+蒸餾水(10份)去除內源性過氧化物酶，隨后5%BSA封閉0.5 h后直接滴加一抗CaN Aα(ABclonal公司，1∶100)4 ℃孵育過夜。PBS沖洗后加入二抗，室溫孵育0.5 h后滴加DAB顯色液，光學顯微鏡下觀察CaN Aα在不同海馬分區的分布并用Image J軟件分析CaN Aα陽性細胞所占百分比，并進行數據統計。

2 結 果

2.1 ELISA檢測結果 SPS組海馬組織勻漿中CaN水平低于健康對照組(t=2.77，P<0.05)，提示單一延長應激后大鼠海馬CaN水平降低(見圖1)。

2.2 Western blot 檢測結果 CaN Aα蛋白在正常腦組織表達較多，尤其是海馬組織[6]。單一延長應激后大鼠海馬CaN Aα的表達明顯降低，與正常對照組比較有顯著差異(t=8.88，P<0.01)(見圖2)。

2.3 免疫組化結果分析 CaN Aα蛋白在正常大鼠和單一延長應激暴露大鼠海馬不同區域的分布。CaN Aα免疫組化陽性產物為棕黃色顆粒，單一延長應激后大鼠海馬CA1、CA3神經元棕黃色顆粒所占面積明顯減少(CA1區兩組比較，t=3.766，P<0.05；CA3區兩組比較，t=5.42，P<0.01)，提示SPS暴露抑制了大鼠海馬CA1、CA3區CaN Aα的表達，而齒狀回(DG)區兩組無明顯差異(t=0.823，P>0.05)(見圖3)。

注：Control代表正常對照組，SPS代表單一延長應激組，單一延長應激組CaN水平明顯降低(P<0.05)

圖1 ELISA方法檢測單一延長應激組與正常對照組海馬勻漿CaN的水平比較

注：Control代表正常對照組，SPS代表單一延長應激組，單一延長應激組CaN Aα 蛋白表達明顯下調(P<0.05)

圖2 兩組海馬CaN Aα 蛋白表達對比

注：Control代表正常對照組，SPS代表單一延長應激組，單一延長應激組海馬CA1區CaN Aα 蛋白表達明顯降低(P<0.05);CA3區CaN Aα蛋白也明顯降低(P<0.01)

圖3 兩組CaN Aα蛋白在不同海馬區域的比較

3 討 論

PTSD多見于嚴重創傷事件后，患者常常表現出現噩夢、高度警惕、持續回避、選擇性遺忘等臨床癥狀[1,2]。既往PTSD歸屬于焦慮障礙性疾病，但2013年第5版《American Psychiatric Association:Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders》(DSM-5)提出“負性情緒和認知改變”也是其常見的臨床癥狀之一，并將其從焦慮障礙中分離出來，歸屬于創傷和應激相關障礙性疾病。2018年WTO第11版《International Classification of Diseases》支持并延續了PTSD的分類，PTSD的臨床診斷標準進一步得到細化和明確，慢性負性情緒與認知改變逐漸被重視和研究。

海馬是機體情緒管理、學習認知、記憶等的重要調控結構[10]。長期負性情緒改變可使海馬神經元可塑性降低、學習記憶能力降低、認知功能衰退和加速腦老化進程。而對海馬體積縮小的PTSD患者給予認知行為治療，患者海馬體積可達到與對照組無明顯差異[11]。由此可見，海馬損傷是PTSD發生發展的關鍵，本研究以海馬為主要研究結構，以探討PTSD的具體發病分子機制。

CaN是大腦內廣泛存在的一種蛋白磷酸酶，參與了恐懼、抑郁、癡呆等許多疾病的發生發展，在神經元興奮性、突觸可塑性、記憶形成、情緒調控等上發揮了重要調控作用[5～7]。CaN抑制劑是臨床上器官移植患者常見的預防和治療排斥反應的藥物，但長期使用可誘導患者出現抑郁樣行為，如早期給予CaN抑制劑治療的腎移植患者中，高達66%的患者出現抑郁[12]。同時動物模型實驗結果發現，大腦杏仁核CaN下調是誘導焦慮和抑郁行為的充分條件[13]，CaN是海馬恐懼記憶的負性調節因子[14]。這些研究提示CaN功能抑制是引起抑郁情緒的重要機制。

在本研究中，我們觀察發現單一延長應激暴露后大鼠海馬組織勻漿CaN水平明顯低于對照組(P<0.05)。而Western blot檢測結果也表明PTSD模型大鼠海馬CaN Aα蛋白表達顯著低于健康對照組(P<0.01)，同時CaN Aα蛋白在海馬CA1、CA3區表達顯著減少(P<0.01)，而齒狀回區(DG)無明顯變化(P>0.05)。這些研究結果提示我們單一延長應激可致大腦海馬CaN下調。鑒于CaN在抑郁、焦慮等負性情緒與恐懼記憶上的重要作用，我們有理由懷疑CaN下調與PTSD抑郁、焦慮、記憶力降低、認知減退有關，該方面尚待進一步深入研究。總之，本研究結果表明單一延長應激可下調大鼠海馬CaN表達，CaN抑制可能是PTSD海馬損傷的重要分子機制之一。