美金剛調控Limk抑制MCAO大鼠Cofilin Rod生成從而減輕腦缺血損傷

陳 斌，高兆鶴，游小芳，林晗瑩，王 晶，林萬慶

目前，中國每年新發腦卒中患者已有250萬人[1]。缺血性卒中(ischemic stroke)約占全部腦卒中的80%[2,3]。2014年我國的腦梗死住院費用為470.35億元[4]。腦卒中不僅嚴重危害人類的生命健康，而且給社會造成巨大的經濟負擔。因此，缺血性腦卒中的有效治療仍然是目前醫療領域研究急需探索的重點項目之一。美金剛(Memantine)是一種具有電壓依賴性、中等程度親和力的非競爭性NMDA受體拮抗劑[5]。較其他的非競爭性NMDA受體拮抗劑，如地卓亞平馬來酸鹽(dizocilpine maleate)具有更快的脫靶率，且對NMDA受體親和力低，具有更快的阻滯/解離藥物動力學特點，以及類似于Mg2+對NMDAR生理學阻滯作用的電壓依賴性的特點，這些阻滯特點使Memantine主要對病理性升高的NMDAR發生阻滯，而不影響NMDAR的正常生理功能[6]。近來的研究表明，Memantine不僅在AD、血管性癡呆、帕金森病和神經性疼痛等神經系統性疾病的基礎和臨床研究中顯示出明顯的神經保護作用，而且在腦卒中的基礎研究中也顯示出良好的效果[7,8]。同時，Memantine治療缺血性卒中的臨床試驗目前也正在進行中(clinical trials.gov identifier:NCT02144584)。但Memantine治療腦缺血損傷的主要分子機制尚不明確，有待進一步闡明。故本研究選用大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型，探討Memantine對MCAO大鼠可能的神經保護機制，為Memantine的臨床治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組 選取體重為(260±15)g的SPF級雄性SD大鼠36只(上海斯萊克實驗動物責任有限公司)，飼養于福建中醫藥大學動物實驗中心，恒溫恒濕控制，12 h～12 h晝夜循環光照，并且給予自由飲食與飲水。使用隨機數字表將其分為：假手術組(Sham)、生理鹽水組(Saline)及美金剛組(MEM)，每組12只。所有試驗均按照國際動物保護和使用指南的相關規定嚴格實施。

1.2 主要試劑和儀器 BCA試劑盒(Thermo Fisher,23227)，ECL試劑盒(Thermo Fisher,32109)。一抗：MAP2(Sigma,M4403)，Cofilin(Cytoskeleton,ACFL02)，GAPDH(Gene Tex,GTX100118)，Limk(CST,3842)，p-Limk(CST,3841S)，p38(Santa cruz,sc-7973)，p-p38(Santa cruz,sc-535)。二抗：Alexa Fluor 555 anti-mouse IgG(A31570),Alexa Fluor 488 anti-rabbit IgG(A21206)均購于Invitrogen公司。儀器：SMZ445體視顯微鏡(Nikon,Japan)，LDF100C激光多普勒(Biopac Systems,USA)，CM1950冰凍切片機(Leica,Germany)，BX58正置熒光顯微鏡(Olympus,Japan)，A1R激光共聚焦系統(Nikon,Japan)。

1.3 動物模型制備 大鼠MCAO模型參考Zea Longa法制備[9]，具體方法如下：SD大鼠術前均禁食但不禁水8 h，在22 ℃室溫下，2%異氟烷對大鼠進行麻醉，置于俯臥位行固定、消毒后，分離軟組織暴露顱骨。應用激光多普勒(LDF100C,Biopac Systems,Goleta,CA)檢測腦血流，待血流值穩定后，記錄5 min，作為血流基準值。然后，在顯微鏡下分離左側頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸內動脈(internal carotid artery，ICA)及頸外動脈(external carotid artery，ECA)(見圖1A)。依次結扎CCA近心端、以及ECA與ICA遠心端，并在ECA上近分叉處約2 mm處剪一“V”型小口，將已消毒好的尼龍線栓(硅膠包被)經ECA插入ICA，直至有少許阻力感時，從ECA與ICA分叉處起計算插入17～17.5 mm，若腦血流降低80%以上，則表明尼龍線栓成功地阻斷了大腦中動脈的血流(見圖1B、C)。隨后傷口常規縫合與消毒，待缺血1 h后拔出尼龍線栓，使血流再通。試驗過程和動物蘇醒期間使用恒溫加熱墊進行保溫，維持肛溫在37 ℃左右。假手術組大鼠只分離動脈，不結扎和插線。

1.4 藥物干預措施 (1)美金剛(Memantine)組：分別于術后5 min給予腹腔注射20 mg/kg的Memantine藥物(4 ml/kg)，12 h后再給予1 mg/kg的Memantine以維持腦內1～10 μmol的濃度，24 h后處死動物取材;(2)生理鹽水(Saline)組：藥物對照組則注射同等劑量的生理鹽水，其余與Memantine組一樣;(3)假手術(Sham)組：注射同等劑量的生理鹽水，不予其他任何干預措施。

1.5 檢測方法及指標 (1)神經行為學評分：采用Zea Longa神經功能評分方法[9]，具體評分標準為：0分，無神經功能缺損體征；1分，提尾時偏癱側前肢不能完全伸展；2分，向偏癱側轉圈；3分，行走時向偏癱側傾倒；4分，不能自發行走，意識喪失；5分，死亡。若伴下列情形之一者將不納入最終的統計分析：①未到取材時間點便死亡者；②取腦時若觀察到蛛網膜下腔出血者；③腦組織形態學檢測未發現缺血性病理改變者。(2)免疫熒光染色法(immunofluorescence)：干預結束后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，經左心室依次灌注生理鹽水和4%多聚甲醛(PFA)溶液各200 ml，使動物呈現出四肢僵硬狀態，隨后取腦浸泡于4%PFA中進行后固定。12 h后使用不同梯度的蔗糖進行脫水，包埋，切片。染片前，將冰凍切片于室溫放置30～45 min，PBS沖洗3次，每次5 min；然后，使用98%甲醇(預冷)破膜3 min，PBS沖洗3次，每次5 min；接著，10%驢血清行封閉60 min；一抗4 ℃冰箱過夜，復溫后PBS沖洗3次，每次5 min；二抗(10%驢血清稀釋)Alexa Fluor 555/488室溫，濕盒中避光室溫孵育1 h，PBS沖洗3次，每次5 min；ProLong gold antifade reagent抗熒光淬滅劑封片凝固后，拍攝分析。(3)蛋白免疫印跡法(Western blot)：干預結束后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，將腦組織按照一定部位分離，于液氮內低溫保存，以備后續提取蛋白。將腦組織從-80 ℃冰箱取出后，按照350 μl /10 mg的比例添加裂解液提取蛋白質。BCA法測定所提出的蛋白質濃度，95 ℃加熱變性，每次取30 μg組織樣本進行SDS-PAGE凝膠電泳和轉膜。室溫條件下，5%的脫脂牛奶封閉60 min，一抗4 ℃過夜孵育，TBS洗滌5次，每次10 min；辣根過氧化物標記的二抗振蕩孵育2 h，TBS洗滌5次，每次10 min；ECL化學發光法顯色，并采用Bio-Image Analysis System(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)顯影成像與分析。

2 結 果

2.1 美金剛改善腦缺血大鼠的神經缺損癥狀 為了確定Memantine對缺血性卒中的神經保護作用，在缺血性卒中后24 h測量MCAO大鼠神經功能缺損得分和腦梗死體積。檢測結果顯示，Saline組和Memantine組的神經功能缺損得分分別為(2.2±0.2)(n=12)和(1.7±0.1)(n=12)，表明Memantine顯著改善MCAO模型的神經系統行為學癥狀(P<0.05)(見圖2)。

2.2 美金剛減小腦缺血大鼠的腦梗死體積 微管相關蛋白(Microtubule associated protein,MAP2)主要在神經元細胞樹突和胞體中表達，可以用來評價腦缺血中神經元損傷的程度，在受缺血影響的腦區觀察到MAP2的表達量明顯減少[10]。用Memantine(20 mg/kg，ip)處理的MCAO大鼠的腦梗死體積從Saline組(生理鹽水處理)的(49.9±4.3)%(n=5)顯著降低至(35.5±2.5)%(n=6)(P<0.05)。梗死體積的減少與MCAO后24 h的神經學改善密切相關。與以前的報道一致[11～14]，這些數據表明Memantine對體內缺血性卒中的治療有一定的功效(見圖3)。

2.3 美金剛抑制腦缺血大鼠皮質梗死區Rod的形成 絲切蛋白(Cofilin)是中樞神經系統肌動蛋白解聚因子家族重要成員之一，負責調控肌動蛋白絲的動力學和重組[15]。在之前的研究中，我們已經觀察到在MCAO大鼠的梗死皮質中有Cofilin與Actin共同形成的Rod棒狀結構，其逐漸誘導微管相關蛋白-2(MAP2)降解和細胞凋亡。我們使用Cofilin的特異性抗體對腦組織切片進行免疫熒光染色，其實驗結果表明，電針治療可以部分抑制皮質缺血區中Rod結構的形成(Area 2：Saline：122.5±44.5/mm2，MEM：11.7±4.6/mm2，P<0.01；Area 3：Saline：275.6±86.7/mm2，MEM：47.2±12.7/mm2，P<0.01；Area 4：Saline：325±68.5/mm2，MEM：108.1±8.7/mm2，P<0.05；Area 5：Saline：432.1±49.3/mm2，MEM：205.1±51/mm2，P<0.05；Area 6：Saline：445.1± 43.7/mm2，MEM：258.5±51/mm2，P<0.05)，但對核心區(Area 7和8)并沒有影響(見圖4)。

2.4 美金剛促進腦缺血大鼠皮質梗死區p-Limk的表達 Cofilin Rod的形成主要是由于去磷酸化的Cofilin含量增加引起的，Cofilin的去磷酸化是其活化形式，而磷酸化的Cofilin則是其失活形式。Cofilin主要受到Limk介導的磷酸化調節而失活[16,17]。為了進一步明確Cofilin參與Memantine誘導的神經保護作用，本研究接下來檢測p-Limk/Limk在腦缺血皮質中的表達情況。Western blot數據顯示：與假手術組相比，在MCAO大鼠缺血皮質中Limk的表達無顯著性差異，p-Limk的表達則下調[Sham：(100±13.5)%，n=6；Saline：(24.6±3.2)%，n= 6；P<0.01]。然而，Memantine干預顯著促進MCAO大鼠缺血皮質中p-Limk的表達[MEM：(92±22.3)%，n=6；Saline：(24.6±3.2)%，n=6；P<0.05]，從而抑制Cofilin Rod的生成。由此證明Memantine在調節缺血性卒中后的Cofilin去磷酸化方面起重要作用(見圖5)。

2.5 美金剛抑制腦缺血大鼠皮質梗死區p-p38的表達 P38絲裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase,p38 MAPK)作為眾多信號轉導通路的中轉站，其激活在細胞凋亡等過程中扮演著重要的角色。本研究通過Western blot檢測p-p38/p38在腦缺血皮質中的表達情況。統計分析結果顯示：與假手術組相比，在MCAO大鼠缺血皮質中p38的表達無顯著性差異，p-p38的表達則顯著升高[Sham：(100±9.52)%，n=6；Saline：(297.17±8.25)%，n=6；P<0.001]。然而，Memantine干預顯著降低MCAO大鼠缺血皮質中p-p38的表達[MEM：(163.39±11.91)%，n=6；Saline：(297.17±8.25)%，n=6；P<0.001]。由此提示Memantine干預可通過調控缺血性卒中后p38的磷酸化，從而減輕MCAO大鼠腦損傷(見圖6)。

圖1 大鼠MCAO模型示意圖

注：Saline：生理鹽水組；MEM：美金剛組。生理鹽水組與美金剛組對比#P<0.05

圖2 美金剛干預MCAO大鼠24 h后神經功能缺損評分

注：A.為MCAO大鼠干預24 h后的腦組織，其中黑色虛線表示的是梗死邊緣；B.為不同層面腦組織的微管相關蛋白(MAP2)免疫熒光染色；C.為腦梗死體積的百分率統計。生理鹽水組與美金剛組對比#P<0.05

圖3 美金剛干預MCAO大鼠24 h后腦梗死體積變化情況

注：A.皮質梗死區Rod分析過程中不同區域(8個)劃分示意圖；B.不同區域絲切蛋白(Cofilin)免疫熒光染色，其中Rod結構如a和b中白色箭頭指示；C.不同區域Rod數量的統計。生理鹽水組與美金剛組對比#P<0.05，##P<0.01

圖4 美金剛干預MCAO大鼠24 h后皮質梗死區Rod的形成情況

注：Western blot法檢測相關蛋白的表達。生理鹽水組與假手術組對比**P<0.01；美金剛組與生理鹽水組對比#P<0.05

圖5 美金剛干預MCAO大鼠24 h后腦梗死皮質中p-Limk/Limk的蛋白表達情況

注：Western blot法檢測相關蛋白的表達。生理鹽水組與假手術組對比***P<0.001；美金剛組與生理鹽水組對比###P<0.001

圖6 美金剛干預MCAO大鼠24 h后腦梗死皮質中p-p38/p38的蛋白表達情況

3 討 論

NMDA受體主要由NR1(必要組成)，NR2和/或NR3亞基組成。其四聚體形式可分為胞外N末端，胞內的C末端，離子通道形成的跨膜段和胞外激動劑結合段4個部分。NMDA受體的內源性激動劑有Glu和天冬氨酸，結合在NR2的胞外激動劑結合段，此外，還依賴于共同激動劑甘氨酸(Glycine)或者絲氨酸(D-serine)，結合在NR1亞基。NMDA受體的生理功能與其在細胞膜上的分布和定位有著密切的關系。NR2A亞基主要分布在突觸內的NMDA受體中，而NR2B主要存在于突觸外受體中。有證據表明，突觸外NR2B的過度激活可能有助于神經毒性的，而突觸內NR2A可能是具有神經保護性的作用。由NMDA受體過度活化引起的神經毒性是缺血性卒中后神經元細胞凋亡的主要原因之一。因此，NMDA受體已被建議作為潛在的治療靶點[6,18,19]。雖然已經發現多種NMDA受體拮抗劑在腦卒中動物模型中具有神經保護作用[20～22]，但之前的臨床試驗所獲得的成功卻是有限的。主要原因有：腦卒中狹窄的治療時間窗口，臨床上不可耐受的副作用，不嚴謹的臨床試驗設計，甚至是缺乏療效[23～25]。

NMDA受體是配體和電壓門控共同調節的雙門控離子通道，對中樞神經系統中生理性和病理性活動都是必需的。之前的NMDA受體阻滯劑可能在阻斷Glu興奮性毒性作用的同時，也阻斷了其正常生理功能的發揮[20,26,27]，以致于臨床應用的失敗[28]。為了在臨床上能夠被接受，抗興奮性毒性藥物必須阻斷NMDA受體的過度激活，同時保持正常的突觸活性以避免副作用。最近的基礎和臨床研究數據表明，Memantine是用于治療腦卒中，減輕腦組織損傷的一種有效可行的藥物[29～33]。Memantine是具有低親和力/快速解離速率的非競爭性NMDA受體拮抗劑，具有優先阻斷高于正常生理水平的病理水平的Glu的潛力。此外，Memantine僅在離子通道開放時選擇性地結合到與NMDA受體Mg2+阻滯位點相重疊的位點，并且一旦離子通道關閉，它就迅速從受體中解離[34～36]。由于這些性質，Memantine可以阻斷過度升高的NMDA受體活性，而不積累在離子通道中以影響NMDA受體正常的生理功能，這可以解釋在使用Memantine治療的患者中副作用是有限的[20,33,37]。在本研究中，我們采用Zea Longa線栓法建立MCAO局灶性腦缺血模型，發現MCAO大鼠缺血后立即給予Memantine可以明顯減輕神經功能缺陷癥狀和腦梗死體積。此結果與其他實驗室的工作是一致的，包括缺血前給藥及缺血后2 h內施以Memantine藥物干預[11～13,31]。

Cofilin是肌動蛋白結合蛋白，受LIMK介導的磷酸化而失活，Cofilin的去磷酸化是其活化的形式[38,39]。越來越多的證據表明，不同神經毒性刺激，可通過增加Cofilin的去磷酸化(激活)，抑制Cofilin的磷酸化(失活)，誘導活化的Cofilin和Actin形成Rod結構[40～44]。有報道表明[10,42]，MAP2結構的完整性會被Cofilin Rod的產生所破壞。為進一步揭示Memantine的治療作用機制，本研究通過Cofilin熒光染色結果顯示(見圖4)，Memantine可明顯抑制MCAO大鼠腦缺血皮質區Cofilin Rod的生成，尤其是在缺血半暗帶。同時，Western blot數據顯示(見圖5)，Memantine可通過促進p-Limk的表達，抑制Cofilin的去磷酸化，從而減少Rod結構的生成。腦缺血損傷會導致p38 MAPK的激活，觸發了下游凋亡途徑，引起Bcl-xL、Bax和AIF等凋亡因子的過度表達，從而引起缺血神經元細胞的凋亡。而Jie等研究指出[45]，抑制p38 MAPK的作用能夠有效地保護神經細胞免受缺血再灌注損傷[46]。另外，研究報道了谷氨酸介導的神經腦組織的p38 MAPK激活，p38 MAPK信號級聯的選擇性抑制為腦缺血再灌注損傷提供了一定的神經保護作用[47]。本研究中，Memantine是一種非競爭性NMDA受體拮抗劑，抑制谷氨酸能系統過度激活，從而降低p38 MAPK信號通路的活化。

綜上所述，NMDA拮抗劑Memantine能夠通過調控腦缺血皮質區p-Limk的表達，抑制Cofilin Rod的形成，降低p-p38的表達，從而改善MCAO大鼠的神經功能缺損癥狀和腦梗死體積。這些結果為Memantine具有減少Rod生成和保護缺血后腦損傷的作用提供了一定的分子基礎，表明Memantine可能是治療缺血性卒中的潛在藥物[48]，但我們仍需要更多的研究來證明這一觀點。