VPS35對多巴胺受體D1降解的調控機制研究

王 琛，肖乃安，馬琪林，詹奕紅

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見的年齡相關的神經變性疾病，病情常呈慢性進行性加重，中樞神經系統中黑質紋狀體等部位的多巴胺能神經元進行性退變、死亡，多巴胺合成或傳導能力減弱，導致錐體外系主導的運動調節功能受損是其主要病理變化。神經遞質多巴胺(dopamine)通過神經末梢上的受體結合，激活下游信號通路，參與多種神經系統的功能。多巴胺受體(Dopamine receptor)為7個跨膜區域組成的G蛋白偶聯 (G protein-coupled)受體家族。目前根據對腺苷酸環化酶(adenylyl cyclase)的激活或者抑制作用已經鑒定出5種多巴胺受體亞型，分為D1類和D2類[1]。前者包括D1和D5受體;后者包括D2、D3、D4受體。囊泡分揀蛋白35(vacuolar protein sorting-35,VPS35)是Retromer復合體(VPS26、VPS29、VPS35和SNXs)的重要原件，主要負責分揀膜蛋白并介導其在胞內體至細胞膜及高爾基體之間的轉運。有研究表明VPS35在帕金森患者的黑質等部位含量下降，且VPS35的D620N 突變與帕金森病發病相關。目前對VPS35缺陷(突變)參與帕金森病發病機制的研究主要集中在線粒體功能障礙，α突觸核蛋白(α-synuclein)堆積以及神經元發育重塑缺陷等方面[2]。

VPS35能夠調控CI-M6PR配體和cathepsin D的內吞再循環，促使α-synuclein通過溶酶體途徑降解，進而減少其異常聚集[3]。除了經典的自噬溶酶體途徑，VPS35還參與蛋白的泛素化降解(Ubiquitin proteasome)，如VPS35能與Hrs相互作用[4]，識別被泛素化修飾的受體，并分揀轉運至溶酶體而降解[5]。在前期的實驗中，我們發現過表達VPS35能夠促進內吞的DRD1蛋白水平迅速下降，一方面，這可能是由于過表達VPS35促進了內吞的DRD1再循環上膜[6]?？紤]到內吞蛋白還可能被轉運到溶酶體降解，我們進一步研究VPS35是否影響DRD1的降解過程。依據CHX可以有效抑制生物體內蛋白的合成原理，我們用放線菌酮(cycloheximide，CHX)處理細胞，來研究VPS35對DRD1的降解可能存在的影響。

1 實驗和材料

1.1 細胞株及神經元 HEK 293T(human embryonic kidney 293T，人胚腎細胞)：廈門大學神經科學研究所提供。

1.2 菌種 E.coli DH5α，廈門大學神經科學研究所提供。

1.3 培養基 (1)細胞培養基 HEK293T培養基：DMEM、10%FBS、1%雙抗;(2)細菌培養基 大腸桿菌培養基：NaCl(10 g)、east Extract(5 g)、Tryptone(10 g)、瓊脂糖粉(15 g)(固體時需加)，加900 ml的單蒸水溶解，5 mol NaOH調pH值至7.0后定容至1 L，高壓蒸汽滅菌120 ℃ 20 min，4 ℃保存。

1.4 質粒 pCMV-myc(哺乳動物表達載體，C端帶有myc標簽)、pCMV-HA(哺乳動物表達載體，C端帶有HA標簽)、DRD1-HA、shVPS35質粒均由廈門大學神經科學研究所構建并保存。VPS35-myc質粒由新加坡分子與細胞生物學研究提供。

1.5 抗體、試劑及化學藥品

1.5.1 抗體 HA-tag (26D11)抗體：Abmart公司；VPS35 抗體：Millipore公司；DRD1、Normal mouse IgG及Myc(9E10)抗體：購自Santa Cruz公司；GAPDH抗體：Cell Signaling Technology公司。

1.5.2 主要試劑及化學藥品 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)：Thermo scientific，Hyclone公司；0.25% Trypsin-EDTA(1×)，(100X) (Penicillin-Streptomycin Solution)雙抗：Invitrogen公司;Neurobasal、FBS(Fetal Bovine Serum)、HBSS及Opti-MEM?I：Gibco公司。限制性內切酶、T4 DNA連接酶、DNA Ladder Marker和Premix PrimerSTAR HS：TaKaRa公司；Rever Tra Ace qPCR RT Kit：TOYOBO東洋紡公司；Protein Ladder：Piercenet公司；放線菌酮(Cycloheximide，CHX)：Sigma-Aldrich公司；MG-132：selleck公司；0.22、0.45 μmol PVDF WB膜：Millipore公司；質粒大提試劑盒：omegascientific公司；醫用X光感藍膠片：白云三和公司；氯化銨、谷胱甘肽、N-N’亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸銨、丙烯酰胺、SDS等分析純均國產。

2 實驗方法

2.1 實驗所需質粒構建 (1)根據Pubmed基因庫人源DRD1基因(Gene ID:1812)序列，用Primer Primer 5.0軟件設計出pcmv-DRD1-HA正向引物：5’-CGGAATTCATGAGGACTCTGAACACCTCTG-3’(限制性內切酶EcoRI )以及反向引物5’-CCTCGAGTCAGGTTGGGTGCTGACCGTTTTGT-3’(XhoI)；由廣州英濰捷基生物公司合成。(2)采用PCR技術從人的胎腦cDNA(互補DNA)文庫中克隆出DRD1的 cDNA，將克隆出的cDNA和pcmv-HA載體用限制性內切酶進行雙向酶切；(3)用T4 DNA 連接酶連接酶切回收的DRD1 cDNA和線性化pcmv-HA載體，連接產物于E.coli DH5α感受態大腸桿菌細胞中轉化，后涂于含氨芐西林抗生素的固體LB培養皿平板上，37 ℃正置30 min后倒置培養12 h～16 h；選取合適的單克隆菌落挑取接種于含氨芐西林的液體LB中，于37 ℃搖床上震蕩培養12 h～16 h；取適量(1～2 μl)菌液進行PCR鑒定，將克隆呈陽性的菌液送至英濰捷基公司雙向測通測序，結果正確的克隆陽性菌液于4 ℃儲存備大提。(4)根據文獻報道[27]已知人源VPS35:shRNA1:5’-TCAGAGGATGTTGTATCTTTACAAGTCTC-3’,shRNA2:5’-GCTTCACACTGCCACCTTTGGTATTTGCA-3’,干擾序列的靶基因mRNA水平干擾效果(見圖1)。

2.2 DRD1降解實驗 于HEK 293T細胞中瞬時轉染DRD1-HA質粒，4 h～6 h后等量傳代至100 mm培養盤中。24 h后瞬時轉染等量的對照載體pcmv-myc和VPS35-myc質粒，或等量的對照shRNA和VPS35-sh1，4 h～6h后等量傳代至6-well培養盤中繼續培養24 h后加500 μmol CHX，根據實驗設計分別處理0 h、1 h、2 h、4 h、6 h和8 h(用DMSO作為0 h對照)，TNEN裂解細胞并Western blotting檢測目的蛋白的表達量，分別用myc和VPS35抗體檢測VPS35，HA抗體檢測外源的DRD1-HA，以GAPDH為內參，膠圖用Image J軟件灰度定量分析，GraphPad Prism 5分析數據并作圖，*P<0.05，**P<0.01。于HEK 293T細胞中瞬時轉染等量的對照載體pcmv-myc和VPS35-myc質粒，4 h～6 h后等量傳代至6-well培養盤中。18 h～24 h后瞬用500 μmol CHX、及20 μmol MG132或者30 mmol NH4CL處理6 h(用DMSO作為0 h陰性對照)，TNEN裂解細胞并Western blotting檢測目的蛋白的表達量，分別用myc標簽抗體檢測VPS35，HA抗體檢測外源的DRD1-HA，以GAPDH為內參，膠圖用Image J軟件灰度定量分析，GraphPad Prism 5分析數據并作圖，*P< 0.05，**P<0.01，***P<0.001，n.s.:not significant。(每組用DMSO處理的DRD1蛋白量定為1)。

2.3 統計學分析 需要定量數據均為3個或3個以上的獨立實驗結果取平均值，用Image J軟件進行灰度定量分析；用Graphpad prism 5統計軟件作圖統計分析，顯著性差異由unpairedttest或paired檢驗確定，用“*”符號表示：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 結 果

我們用CHX處理細胞，來研究VPS35對DRD1的降解可能存在的影響。首先在穩定表達外源性帶HA標簽的人源DRD1蛋白的HEK293T細胞中瞬時轉染對照載體pcmv-myc和VPS35-myc質粒(見圖2A)，4 h～6h后等量傳代至6-well培養盤中繼續培養24 h后加500 μmol CHX，根據實驗設計分別處理0 h、1 h、2 h、4 h、6 h和8 h(用DMSO作為0 h對照)，TNEN裂解細胞并Western blotting檢測目的蛋白的表達量。結果顯示在過表達VPS35之后，DRD1蛋白的降解速率比對照組加快了，說明VPS35促進了DRD1的降解。相反的，在下調VPS35水平后(見圖2B)，DRD1蛋白的降解速率比對照組減慢了。這些結果表明，VPS35能夠調控DRD1的降解。

為了更深入地了解VPS35對DRD1降解的調控方式，我們采用20 μmol MG132和30 mmol NH4CL處理細胞作為陽性對照，DMSO作為0 h陰性對照(見圖2C)的降解實驗來分析VPS35調控DRD1降解的途徑。用TNEN裂解細胞并Western blotting檢測目的蛋白的表達量。結果顯示,在轉Vector細胞中，NH4Cl和MG132處理組的DRD1蛋白量比對照組都有所升高，但NH4Cl組升高更明顯，提示DRD1在正常情況下主要通過溶酶體途徑降解，這與七次跨膜蛋白的降解特點相吻合。而在轉VPS35細胞中，NH4Cl和MG132處理組的DRD1蛋白量比對照組的升高趨勢較Vector組都有所增加，提示VPS35過表達時，能增加DRD1的溶酶體和泛素蛋白酶體降解，但增加溶酶體降解的效果更加顯著，因此抑制溶酶體才能更多地恢復其水平。

注：HEK293T細胞中轉染 hVPS35,shRNA及對照質粒。 72 h后收集細胞提RNA并反轉錄， β-actin作為內參，Real-time PCR檢測hVPS35表達量*P<0.05，**P<0.01

圖1 靶基因mRNA水平干擾效果

注：在過表達VPS35之后(A)，DRD1蛋白的降解速率與對照組比較；在下調VPS35水平后(B)，DRD1蛋白的降解速率與對照組比較;過表達VPS35、CHX及20 μmol MG132或者30 mmol NH4CL處理細胞(用DMSO作為0 h陰性對照)(C)，DRD1蛋白的降解程度之間比較，以GAPDH為內參，膠圖用Image J軟件灰度定量分析，GraphPad Prism 5分析數據并作圖*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n.s.:not significant(每組用DMSO處理的DRD1蛋白量定為1)

圖2 VPS35影響DRD1的降解

4 討 論

帕金森病是一種病情呈進行性加重神經變性疾病，已成為威脅中老年人健康的“殺手”之一，PD多發于60歲以上的老年人群中，且低齡化趨勢愈發加重。由于PD是中樞神經系統退行性疾病，黑質紋狀體等部位的多巴胺能神經元進行性退變、死亡，多巴胺合成或傳導能力減弱，導致錐體外系主導的運動調節功能受損是PD的主要病理變化。PD的一個重要病理特征就是α-synuclein突觸核蛋白異常聚集形成的路易小體(Lewy body)。此外，MPTP和rotenone等環境毒素的影響造成神經元線粒體的功能障礙，促進氧化應激和有害自由基的生成，也會致使多巴胺能神經元大量變性死亡[7]。目前對PD發病機制的研究主要涉及遺傳、年齡老化、環境、免疫炎癥、氧化應激、線粒體功能障礙、細胞凋亡等方面。已被證實與PD相關的基因包括α-synuclein(PARK1、PARK4)、Parkin基因(PARK2)、UCH-L1(PARK5)、PINK1(PARK6)、DJ-1(PARK7)、LRRK2(PARK8)、ATP13A2(PARK9)、GBA等數10種[8]。PD 致病基因多樣化證實了遺傳多態性在PD發病中所起的重要作用。

VPS35是Retromer復合體的最重要元件，它與VPS26和VPS29 組成復合體并與GTP以及Rab7相互作用于EEA[9]，在流動性下降的同時募集更多的貨物蛋白，繼而形成穩定的成核復合體，從endosome向TGN中以囊泡的方式轉運高爾基體、內質網、溶酶體、核膜等部位之間的大小不同的顆粒物質[10]，保證了許多跨膜的受體蛋白的代謝平衡和重復利用[11]。研究表明VPS35的常染色體顯性突變D620N(Asp620Asn)、P316S(Pro316Ser)、R524W(Arg524Trp)等會導致PD發病[12]，但具體病理機制尚不明確，目前關于突變體及VPS35表達不足或功能缺失,對于PD的致病機制研究主要集中在α-synuclein 的異常聚集[13]、線粒體功能障礙導致多巴胺能神經元的損失[14]、抑制VPS35與WASH復合體結合[15]、增加MPP+的毒性作用[16]、干擾AMPA 受體的轉運、神經元突觸成熟障礙[17]等方面。

有研究顯示，VPS35缺乏對多巴胺能神經元的損傷尤其嚴重，并且在臨床PD患者的黑質區域也出現了VPS35減少的現象[18]。抑制VPS35的表達會導致新生的海馬區神經元樹突棘和軸突腫脹而表現出變性樣的形態。有趣的是PD的病理特點是這些區域的多巴胺能神經元的變性死亡,而這些域也是DRD1表達最豐富的部位。一些研究證實,參與細胞內外物質轉運的蛋白介質如DRiP78[19]、COPI[20]、SNX5[21]等都能與DRD1相互作用并調控其在質膜和細胞表面的運輸和成熟分布。在化學性質上，DRD1屬于G蛋白偶聯(G protein coupled)受體家族的七次跨膜蛋白，其從產生、運輸以及最終成熟定位在細胞膜上，時刻處于一個動態的過程。VPS35與GTP以及Rab7相互作用并與早期內體(early endosome)結合[9]，由胞內體向高爾基體網狀結構逆向轉運細胞膜、高爾基體、內質網、溶酶體、核膜等部位之間的貨物蛋白，這些蛋白與DRD1的生化性質以及轉運特點都高度相似。根據相關報道顯示，在VPS35參與轉運的貨物蛋白中，有些與神經退行性疾病密切相關，如APP[22]、BACE1[23]、AMPA 受體[24]等，作為PD中有重要作用的DRD1，我們猜想VPS35是否也能夠調控其轉運過程。前期研究結果表明，VPS35雖然對DRD1的基因表達水平影響不大，但能夠有效增加DRD1蛋白在細胞膜上的水平，從而增加接受傳導多巴胺的受體數量，并且促進內吞入胞的DRD1再循環至細胞膜上，而內吞入胞的DRD1除了再循環返回細胞膜上[6]。在本文降解實驗中，我們發現VPS35能夠顯著促進胞內DRD1通過溶酶體途徑降解(見圖2)。有趣的是，之前有報道顯示VPS35與VPS26和VPS29在EEA的囊泡表面形成復合體，將Cargo蛋白逆向轉運至TGN，避免其被運至溶酶體而降解[25]，而有些研究結果則表明VPS35促進諸如α-synuclein等蛋白的降解，從而減少神經損傷[26，27]。因此VPS35對DRD1降解調控的具體機制仍需要更深入地探索研究。VPS35的D620N、R524W、P316S等突變已被證實與PD相關，我們前期證實VPS35(D620N c.1858G>A)突變不能有效地調控細胞膜上DRD1的內吞及再循環上膜及在信號轉導，說明D620N突變干擾了VPS35的正常生理功能，而VPS35的相關突變是否影響DRD1的降解也有待進一步研究闡明。

本研究證實了VPS35有效通過溶酶體途徑調控DRD1的降解，隨著對VPS35功能的深入研究，其在以帕金森病和阿爾茨海默病為代表的神經退行性疾病中的相關作用機制也將得到更加詳盡的揭示。