白香丹膠囊配伍四逆散治療焦慮大鼠的療效及其對(duì)血清NE、5-HT、BDNF水平的影響

焦慮癥是以焦慮情緒為主要特點(diǎn)的常見神經(jīng)癥，臨床表現(xiàn)為持續(xù)性、廣泛性的緊張、驚恐不安，同時(shí)伴肌肉緊張、神經(jīng)紊亂、運(yùn)動(dòng)性不安。目前西醫(yī)治療以丁螺環(huán)酮、苯二氮卓類等藥物為主，但易出現(xiàn)耐受性及不良反應(yīng)，依從性差[1]。近年來(lái)中醫(yī)藥治療焦慮癥優(yōu)勢(shì)突出。有研究表明，四逆散對(duì)心理應(yīng)激密切相關(guān)的焦慮、抑郁具有治療效果[2]；白香丹膠囊由香附、白芍、丹皮等有效成分組成，已有研究證實(shí)其對(duì)神經(jīng)精神性疾病癥狀存在改善作用[3]。但目前關(guān)于二者的作用機(jī)制及配伍治療效果的研究報(bào)道較少。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)以及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)水平與神經(jīng)病癥的產(chǎn)生、進(jìn)展有關(guān)[4-5]?；诖耍狙芯坎捎米愕纂姄舴?gòu)建焦慮大鼠模型，旨在探討白香丹膠囊配伍四逆散干預(yù)治療焦慮的效果及其對(duì)血清NE、5-HT及BDNF水平的影響，探討其作用機(jī)制，為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取48只SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心[實(shí)驗(yàn)合格證：XJYK(新)2017-0020]。大鼠體質(zhì)量180～210 (200.08±26.73)g。實(shí)驗(yàn)前7 d購(gòu)入并安置于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境：室溫(22±2)℃，濕度50%～60%，光照節(jié)律12L/12D(08：00～20：00)；自由飲水、攝食。

1.2 藥物及試劑 白香丹膠囊(青島海川生產(chǎn))；四逆散(廣州一方制藥有限公司)。組方：白芍、柴胡、炙甘草、枳實(shí)顆粒劑，均12 g。NE、5-HT試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；BDNF試劑盒(美國(guó)R&D公司)。

1.3 主要儀器 XR-XZ301型曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱、XR-XG201型高架十字迷宮(EPM)、XR-Xmaze型動(dòng)物行為分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司)；ST-A數(shù)字脈沖生物刺激儀(濟(jì)南空軍后勤裝配總廠聯(lián)合山東中醫(yī)藥大學(xué)研制)；Universal 16R臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Hettich)。

1.4 方法

1.4.1 焦慮大鼠模型制備及實(shí)驗(yàn)分組 大鼠經(jīng)7 d適應(yīng)環(huán)境后，隨機(jī)分為4組：空白組、模型組、四逆散組、中藥聯(lián)合組，每組12只。空白組，不行電擊，正常飼養(yǎng)，每日給予10 mL/kg無(wú)菌純水灌胃。模型組通過(guò)ST-A數(shù)字脈沖生物刺激儀，憑借足底電擊法誘導(dǎo)大鼠焦慮行為，即放置大鼠于激惹、噪音、脈沖電刺激籠中，以足部刺激為主，電壓2 800～3 300 V，電流0.5 mA，脈寬0.3 s，白晝、夜間分別2檔(間隔5 min)、3檔(間隔10 min)，刺激持續(xù)2周，造模同時(shí)每日給予10 mL/kg無(wú)菌純水灌胃。四逆散組造模方法不變，每日給予四逆散水煎液3.6 g/kg灌胃。中藥聯(lián)合組，造模方法不變，每日給予白香丹膠囊200 mg/kg+四逆散水煎液3.6 g/kg灌胃。4組均干預(yù)觀察2周。

1.4.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 將大鼠置于曠場(chǎng)試驗(yàn)箱(50 cm×50 cm×40 cm)中央，攝錄5 min行為活動(dòng)，采用Xmaze動(dòng)物行為分析系統(tǒng)分析大鼠行為變化，統(tǒng)計(jì)大鼠曠場(chǎng)運(yùn)動(dòng)總距離、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間，以評(píng)估運(yùn)動(dòng)能力。

1.4.3 EPM實(shí)驗(yàn) EPM實(shí)驗(yàn)前將大鼠置于60 cm×60 cm×35 cm的塑料箱中適應(yīng)環(huán)境，5 min后迅速將其放于EPM中央，確保大鼠頭部朝向開放臂。測(cè)試5 min，結(jié)合Xmaze動(dòng)物行為分析系統(tǒng)，測(cè)定大鼠5 min內(nèi)行為指標(biāo)以及評(píng)估焦慮狀態(tài)，包括進(jìn)入開放臂時(shí)間(OT)、進(jìn)入開放臂次數(shù)(OE)、進(jìn)入封閉臂時(shí)間(CT)、進(jìn)入封閉臂次數(shù)(CE)。計(jì)算開放臂進(jìn)入次數(shù)比例(OE%)、開放臂停留時(shí)間比例(OT%)；OE%=OE/(OE+CE)×100%，OT%=OT/(OT+CT)×100%[6]。

1.4.4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，對(duì)大鼠斷頭處死并取血，以12 000 r/min速率離心5 min，取上清于-80 ℃保存?zhèn)錅y(cè)。2 h內(nèi)采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清NE、5-HT及BDNF水平。操作嚴(yán)格遵循試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 模型組曠場(chǎng)運(yùn)動(dòng)總距離長(zhǎng)于空白組，中央?yún)^(qū)停留時(shí)間短于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而相比四逆散組，中藥聯(lián)合組曠場(chǎng)運(yùn)動(dòng)總距離縮短，中央?yún)^(qū)停留時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.05)，且與空白組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 4組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(±s)

與模型組比較，1)P<0.05；與四逆散組比較，2)P<0.05

2.2 4組大鼠EPM實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 模型組大鼠OE%、OT%均低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中藥聯(lián)合組大鼠OE%、OT%均高于四逆散組(P<0.05)，而與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 4組大鼠EPM實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(±s)

與模型組比較，1)P<0.05；與四逆散組比較，2)P<0.05

2.3 4組大鼠血清NE、5-HT、BDNF水平比較 模型組大鼠血清NE、5-HT水平高于空白組，BDNF水平低于空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中藥聯(lián)合組血清NE、5-HT水平低于四逆散組(P<0.05)，BDNF水平高于四逆散組(P<0.05)，而與空白組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 4組大鼠血清NE、5-HT、BDNF水平比較(±s)

與模型組比較，1)P<0.05；與四逆散組比較，2)P<0.05

3 討 論

焦慮癥類屬中醫(yī)學(xué)“情志病”范疇，主要癥狀散見于古醫(yī)籍“郁證”“驚悸”“臟躁”等病癥中?！端貑?wèn)》載：“驚則心無(wú)所倚，神無(wú)所歸，慮無(wú)所定，故氣亂矣?！鼻业溃骸皶r(shí)驚……是腎不足也。”《醫(yī)碥》云：“郁而不舒，則皆肝木之病矣?！敝赋隽嗽摬“Y狀及有關(guān)病機(jī)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，焦慮癥病機(jī)主要在于肝失疏泄，氣郁化火生痰，擾心耗氣，引發(fā)氣郁及交感神經(jīng)癥狀(驚悸等)；或七情過(guò)極，臟腑功能失調(diào)，氣血失和，誘發(fā)躁動(dòng)、坐臥不安等癥。故治療應(yīng)以疏肝解郁、理氣調(diào)血為原則[7-8]。四逆散源自《傷寒論》，組方中白芍平肝養(yǎng)血，柴胡疏肝解郁，枳實(shí)破氣消積，炙甘草滋陰陽(yáng)并調(diào)和諸藥。全方共奏平肝解郁、調(diào)氣養(yǎng)血之功[9]。現(xiàn)代藥理研究表明，白芍、柴胡具有鎮(zhèn)靜、護(hù)肝作用；枳實(shí)可抗疲勞、耐缺氧，具有中樞抑制作用；炙甘草對(duì)躁狂抑郁性精神病、焦慮性神經(jīng)癥具有改善作用[10-11]。白香丹膠囊由白芍、丹皮、香附的有效成分(芍藥苷、丹皮酚和α-香附酮)配伍組成。丹皮清熱活血，香附引氣解郁。且現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，芍藥苷、丹皮酚不僅可鎮(zhèn)靜、抗驚厥，還能促進(jìn)海馬神經(jīng)元存活、生長(zhǎng)；丹皮酚亦可抑制小鼠扭體反應(yīng)、運(yùn)動(dòng)亢進(jìn)，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)；α-香附酮?jiǎng)t善調(diào)氣血、疏肝強(qiáng)心[12-13]。有關(guān)研究表明，白香丹膠囊可緩解焦慮大鼠情緒，增加大鼠體重及糖水偏好系數(shù)[14]。

本研究通過(guò)足底電擊法誘導(dǎo)大鼠焦慮樣行為，采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、EPM實(shí)驗(yàn)評(píng)估藥物抗焦慮作用。其中曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)總距離、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間反映大鼠興奮度；EPM實(shí)驗(yàn)利用大鼠對(duì)新環(huán)境的探究特征及對(duì)敞開臂的驚恐心理，構(gòu)成矛盾沖突，以O(shè)E%、OT%反映大鼠焦慮狀態(tài)。研究結(jié)果顯示，模型組曠場(chǎng)運(yùn)動(dòng)總距離長(zhǎng)于空白組，中央?yún)^(qū)停留時(shí)間短于空白組，OE%、OT%均低于空白組，表明焦慮大鼠造模成功；而相比模型組，中藥聯(lián)合組、四逆散組曠場(chǎng)運(yùn)動(dòng)總距離縮短，中央?yún)^(qū)停留時(shí)間延長(zhǎng)，OE%、OT%水平亦增高；中藥聯(lián)合組相比四逆散組上述指標(biāo)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與空白組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示白香丹膠囊聯(lián)合四逆散、單用四逆散均具有抗焦慮作用，且中藥聯(lián)合效果優(yōu)于四逆散單用治療。經(jīng)分析與組方功效有關(guān)外，可能還與以下因素有關(guān)：白香丹膠囊組分對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在不同調(diào)節(jié)作用，配伍四逆散可發(fā)揮多靶點(diǎn)、多途徑、多環(huán)節(jié)協(xié)同調(diào)衡效用，進(jìn)而提高療效。白香丹膠囊中丹皮酚在抗焦慮藥物制備中應(yīng)用效果顯著，芍藥苷具有顯著神經(jīng)保護(hù)、抗焦慮作用[15-16]。因而中藥聯(lián)合用藥效果更顯著。

目前認(rèn)為，焦慮障礙的發(fā)生與神經(jīng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)等作用有關(guān)。BDNF是腦內(nèi)促神經(jīng)生長(zhǎng)的活性蛋白質(zhì)，被作為神經(jīng)元功能調(diào)控因子，亦是應(yīng)激所致海馬神經(jīng)元損傷的重要機(jī)制。Gawali等[17]研究表明，慢性應(yīng)激可促使BDNF表達(dá)降低，而抗焦慮治療后BDNF表達(dá)升高，焦慮狀態(tài)改善。另有資料顯示，焦慮模型大鼠血清BDNF水平相比空白組大鼠降低，BDNF與5-HT關(guān)系密切[18]。5-HT、NE神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)被認(rèn)為與焦慮癥發(fā)病機(jī)制有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，血清5-HT、NE在焦慮大鼠中表達(dá)水平升高[19]。ELISA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藥物干預(yù)可促使焦慮大鼠血清5-HT、NE水平降低[20]。本研究顯示，模型組大鼠血清NE、5-HT水平高于空白組，BDNF低于空白組；相比模型組，中藥聯(lián)合組、四逆散組血清NE、5-HT水平降低，BDNF水平升高，且中藥聯(lián)合組與四逆散組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示中藥聯(lián)合干預(yù)對(duì)焦慮癥大鼠NE、5-HT、BDNF表達(dá)調(diào)節(jié)優(yōu)于四逆散單用治療。四逆散中白芍可改善慢性應(yīng)激狀態(tài)下BDNF表達(dá)，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平；而白香丹膠囊中丹皮酚可促海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)，配伍芍藥苷可增強(qiáng)中樞神經(jīng)及神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，白香丹膠囊配伍四逆散治療焦慮大鼠具有顯著效果，其機(jī)制與上調(diào)BDNF表達(dá)及下調(diào)NE、5-HT水平有關(guān)。而對(duì)于具體成分的具體作用途徑仍有待進(jìn)一步研究明確。