結締組織生長因子對大鼠放射性心臟損傷作用的實驗研究

放射性心臟損傷(radiation induced heart disease，RIHD)即胸部腫瘤放療引起的常見遲發性不良反應之一，可明顯增加長期生存病人的死亡風險[1]。放射性心肌纖維化是RIHD的重要病理過程[2]。結締組織生長因子(connective tissue growth factor， CTGF)可誘導組織發生纖維化[3-4]，然而目前研究對CTGF與放射性心肌纖維化的確切機制并不清楚。基于此，本實驗觀察大鼠受照射后心臟CTGF mRNA、蛋白水平隨時間的變化，并分析其與RIHD發生發展的關系，為進一步治療RIHD的實驗研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 雄性SD大鼠18只(12～14 周)，由山西醫科大學實驗動物中心提供，體重200～230 g，均給予標準大鼠飼料和潔凈自來水任其自由攝取。所有實驗大鼠采用隨機數字表法隨機分為3組，對照組(6只)：心臟不接受照射(0 Gy)；心臟照射后3個月(3M)組(6只)：心臟接受照射(20 Gy)后飼養3個月；心臟照射后6個月(6M)組(6只)：心臟接受照射(20 Gy)后飼養6個月。

1.2 RIHD模型制備 心臟照射組SD大鼠以3%戊巴比妥鈉(20 mg/kg)腹腔內注射麻醉，取仰臥位將四肢固定自制的木板上，照射野大小設3 cm×3 cm，上界在胸骨角下緣，下界為上界向劍突方向下移3 cm，左界以中線向左旁開2cm，右界為中線向右旁開1 cm。制作鉛塊防護肺及腹部器官，位置驗證后，以直線加速照射，6Mv X線，單次照射劑量20 Gy，劑量率300 Gy/min，照射距離1 m，劑量計算點濃度2.5 cm。1.3 Masson′s三色染色 取心肌組織用10%甲醛固定，石蠟包埋后制備5 μm切片，脫蠟至水化，Masson染色后，常規脫水透明，中性樹膠封固。通過全自動圖像分析系統對膠原進行定量分析，計算間質膠原容積分數(CVF)。

1.4 RT-qPCR檢測心肌組織CTGF和纖維粘連蛋白(FN)mRNA 按試劑盒說明用TRIzol?試劑(9108，TaKaRa，Japan)提取心肌組織的總RNA。根據制造商提供的方案合成cDNA。CTGF和FN的引物由上海生物工程有限公司設計并合成，序列：CTGF，上游：5′-CCTGACCCAACT ATGATGC-3， 下游：5′- CCCTTACTCCCTGGCTTT-3； FN，上游：5′- TCG CTTTGACTTCACCAC-3′，下游： 5′- CTTCCTCGCTCAGTTCGT-3； 3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)， 上游：5′-GGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游：5′- GGAAGATGGTGATGGGATT-3′。樣本相對于GAPDH的倍數變化通過比較Ct法即2-ΔΔCt計算得到。

1.5 Western Blotting檢測心肌組織CTGF和FN的蛋白表達 將心肌組織加入冰冷的裂解液中分離提取總蛋白，根據BCA蛋白測定試劑盒說明(Piece， Carlsbad， CA， USA)進行檢測。特異性CTGF多克隆抗體(1∶400；sc-365970；Santa Cruz Biotechnology， Inc.)和FN多克隆抗體(1∶500；sc-53286；Santa Cruz Biotechnology， Inc.) 濃度(1∶2 000)，二抗濃度(1∶5 000)用Image J軟件(NIH， MA， USA)分析條帶，目的蛋白與內參蛋白灰度值的比即為樣品目的蛋白的相對含量。

2 結 果

2.1 Masson′s 三色染色 對照組心肌纖維結構清晰，幾乎無膠原蛋白染色； 3M組心肌細胞間及血管周可見膠原含量增多；而6M組心肌細胞間及血管周膠原成分比3M組增加更加明顯(見圖1)。圖像分析系統定量分析測算心肌膠原容積分數(CVF)，3M組為(4.45±0.30 )%，對照組為(3.33±0.14 )%，兩組比較差異具有統計學意義(P<0.01)，6M組(5.88±0.20)%與對照組、3M組相比均有增高，差異有統計學意義(P<0.01)。詳見圖2。

與對照組比較，*P<0.01；與3M組比較，#P<0.01

2.2 大鼠心臟照射后 CTGF mRNA、FN mRNA表達水平的變化 與對照組相比， 3M組CTGF和FN mRNA表達明顯增加(P<0.01)；6M組與對照組相比增加更明顯(P<0.01)，且比3M組表達亦增高(P<0.01)。詳見圖3。

與對照組比較， *P<0.01；與3M組比較，#P<0.01

2.3 Western blot 檢測蛋白表達的結果 與對照組相比， 3M組、6M組CTGF 和FN蛋白表達明顯增加(P<0.01)；且6M組比3M組表達亦增高(P<0.01)。詳見圖4。

與對照組比較， *P<0.01；與3M組比較，#P<0.01

2.4 CTGF與心肌組織纖維化程度的相關性分析 心臟受照后隨時間延長纖維化程度的CVF 指標與CTGF mRNA (r=0.959，P<0.01)、CTGF蛋白(r=0.932，P<0.01)表達均呈正相關。

3 討 論

本研究可見，大鼠心臟被輻射3個月后心肌細胞出現變性，間質及小血管管周出現纖維化，6個月后變性加重，心肌壞死，纖維化間質及小血管管周纖維化更加明顯。與既往動物實驗一致，心臟被輻射可形成放射性心肌纖維化[2]。輻射引起的心肌纖維化和重塑可能引起心臟功能障礙[5-6]。

本研究發現，大鼠心臟受照射3個月后CTGF mRNA 和蛋白表達均增高，且受照射6個月后增加更明顯；而細胞外基質的主要成分FN表達也有同樣表現，提示CTGF有促纖維化的作用。同時本研究對心肌組織進行Masson′s 三色染色，并通過定量分析CVF，發現心臟纖維化也隨輻射后時間延長進行性加重，并且心肌纖維化程度與CTGF表達水平呈正相關。以上結果均提示CTGF在RIHD的發生發展中有重要作用。

有研究證明，轉化生長因子-β1(TGF-β1)參與介導多個器官纖維化病變的發生發展過程，同時也是與放射性纖維化密切相關的細胞因子[7-9]。Liu等[10]的前期研究提示，大鼠心臟在接受20 Gy 照射后，心肌組織TGF-β1mRNA 表達水平在受照射后第2周可達到高峰，第4周下降，此后逐漸升高，至第12周達到第2個高峰，但較第2周略低。提示TGF-β1不僅參與放射性心臟損傷的起始過程，而且在其發展階段仍然起著一定的作用。在臨床實驗中，已有研究運用己酮可可堿和生育酚以減少放射性纖維化的發生[11]，但由于TGF-β1除了促纖維化效應，還有抗增生和抗炎癥的效應，長期完全阻斷TGF-β1系統勢必產生嚴重后果[12]。TGF-β1是CTGF的誘導劑， TGF-β1的生物學作用部分由CTGF介導的，在組織纖維化中起重要作用。有研究發現，在放射性腎臟損傷、放射性肺損傷、放射性肝臟損傷的嚙齒類動物模型中CTGF表達亦明顯增高，說明CTGF參與了放射性纖維化的過程[13-14]。在非人的靈長類動物中，同樣發現CTGF與多器官的放射性纖維化有關[15]。然而目前CTGF與放射性心肌纖維化的文獻研究較少。本研究分析CTGF與放射性心肌纖維化的作用，提示CTGF在RIHD的發生發展中具有重要參與作用。

心臟被輻射可引起心肌進行性纖維化而發生心室重構，導致心功能下降。CTGF在放射性心肌纖維化的進程中起著關鍵作用，靶向抑制 CTGF可能對RIHD有防治作用。