星狀神經節阻滯對老年大鼠海馬區Bcl-2、Bax表達及術后認知功能的影響

郝建紅，蔡文博，劉小兵，郭 斌，董補懷，高子軍

西安交通大學附屬紅會醫院麻醉科(西安 710054)

術后認知功能障礙(Postoperative cognitive dysfunction，POCD)是老年患者術后常見并發癥，POCD可導致老年患者病死率增加，身體康復延遲，并發癥增多,給家庭和社會帶來負擔[1-2]。研究表明大鼠認知功能受損與海馬神經元受損有關[3]。研究發現星狀神經節阻滯(Stellate ganglion block，SGB)可改善老年患者術后認知功能[4-5]。然而，對于星狀神經節阻滯改善老年患者術后認知功能的機制尚未完全清楚。因此，我們設計此課題研究星狀神經節阻滯是否通過調控海馬Bcl-2、Bax的表達，減少海馬神經元凋亡，改善老年大鼠術后認知功能。

材料與方法

1 實驗動物及分組 健康雄性SD大鼠72只，18～20月齡，體重500～700 g。采用隨機數字表法，將其隨機分為三組，對照組、模型組和星狀神經節阻滯組(SGB組)，每組24只。對照組不作任何處理；模型組實施剖腹探查術建立老年大鼠術后認知功能障礙模型；SGB組實施星狀神經節阻滯及剖腹探查術。

2 研究方法

2.1 模型制備：SGB組大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，仰臥位固定，使用4.5 號注射器針頭在胸鎖關節外方0.3 cm 處(穿刺時緊貼鎖骨下緣) 作為穿刺點垂直進針進行穿刺，回抽無血、無腦脊液后，注射0.25%布比卡因0.15 ml。以出現Horner征為SGB阻滯成功的標準。星狀神經節阻滯后15 min，模型組和SGB組腹腔注射3%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，實施剖腹探查術30 min，術中監測大鼠心率和血氧飽和度，術中血氧飽和度<95%大于5 min的大鼠予以剔除。術畢腹腔內給予青霉素、縫合切口、膠布固定。大鼠蘇醒后放回鼠籠各自飼養。

2.2 認知功能測試：采用Morris水迷宮進行認知功能測試。實驗前1 d所有大鼠在水迷宮內自由游泳5 min以適應環境。手術后1～5 d,每天上午8—10點進行定位航行試驗，大鼠在120 s內尋找到平臺用時為逃避潛伏期。大鼠在120 s內不能登臺，引導其登臺并停留20 s,逃避潛伏期記為120 s。逃避潛伏期實驗后1 d，移走平臺，將大鼠由原先平臺象限面向池壁放入水迷宮，記錄大鼠在120 s內穿越原先平臺所在位置的次數。

2.3 Tunel法檢測海馬CA1區神經元凋亡：術后7 d水迷宮認知功能測試后，將大鼠在麻醉(氟烷)狀態下開胸，暴露心臟，用10%多聚甲醛固定液灌注。先灌注50 ml，之后用微量靜脈輸液泵滴注100 ml固定液，取腦進行外固定。將固定后的腦組織從視交叉后2 mm取3～4 mm厚冠狀切面，經過常規的70%～100%的乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟浸透包埋后，做連續切片，切片厚度約為4m，貼在多聚賴氨酸防脫片劑處理過的載玻片上，按照POD試劑盒內說明書進行。

2.4 免疫組化法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達：在每只大鼠中隨機圖像選取6張切片做免疫組化染色(SP法)，操作依據試劑盒說明書進行。兔抗大鼠多克隆抗體按1∶100稀釋；PBS代替一抗作陰性對照。結果用Minvnl分析系統對免疫組化陽性結果進行半定量分析。

結 果

1 認知功能測試 術后3、5 d定位航行試驗，與對照組比較，模型組大鼠水迷宮實驗的逃避潛伏期顯著延長(P<0.05)； 與模型組比較，SGB組大鼠水迷宮實驗的逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05),見表 1。術后7 d進行空間探索實驗，測原平臺穿越次數，與對照組比較，模型組大鼠穿越平臺次數顯著減少(P<0.05)；與模型組比較，SGB組大鼠穿越平臺次數顯著增加(P<0.05) ,見表2。

表1 三組術后3、5 d定位航行試驗逃避潛伏期時間比較(s)

注：與對照組比較，*P<0.05;與模型組比較，△P<0.05

表2 三組術后7 d空間探索實驗穿越平臺次數比較

注：與對照組比較，*P<0.05;與模型組比較，△P<0.05

2 三組大鼠術后7 d Tunel法測定海馬區神經元凋亡 對照組少見凋亡細胞，模型組、SGB組見凋亡細胞。與對照組比較，模型組大鼠海馬區神經元凋亡率明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，SGB組大鼠海馬區神經元凋亡率明顯降低(P<0.05)。見圖1、2。

A：對照組；B：模型組；C：SGB組

注：與對照組比較，*P<0.05;與模型組比較，△P<0.05

圖2三組大鼠海馬區神經元凋亡率比較

3 三組大鼠術后7 d海馬區Bcl-2、Bax蛋白表達 與對照組比較，模型組大鼠海馬區Bcl-2表達水平顯著下降(P<0.05)，Bax表達水平顯著升高(P<0.05)；

與模型組比較，SGB組大鼠海馬區 Bcl-2表達水平顯著升高(P<0.05)，Bax表達水平顯著下降(P<0.05)。見圖 3、4、5。

注：與對照組比較，*P<0.05;與模型組比較，△P<0.05

圖3三組大鼠海馬區Bcl-2和Bax蛋白表達比較

A：對照組；B：模型組；C：SGB組

A：對照組；B：模型組；C：SGB組

討 論

目前對于老年 POCD 的動物模型普遍采用老年大鼠麻醉后行剖腹探查術建立POCD 動物模型。Morris 水迷宮實驗廣泛應用于動物認知功能的測定[6-7]。Morris 水迷宮實驗主要包括定位航行實驗和空間探索實驗，前者通過測定動物尋找平臺的時間測試學習能力，后者通過測定動物穿越平臺原位置的次數測試大鼠記憶能力。本研究中Morris 水迷宮實驗結果顯示，模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長，穿越平臺次數顯著減少，說明大鼠在接受麻醉和手術后學習記憶能力下降，表現出認知功能障礙。

海馬存在于額葉內側，是參與學習和記憶功能的重要部位。近年來研究發現大鼠認知功能障礙與海馬區神經元的凋亡有關[8]。細胞凋亡(Apoptosis)是細胞在誘導因子作用下，啟動自身基因的調控機制，發生的一種自主性、程序性細胞死亡過程。Bcl-2、Bax 是有關細胞凋亡的重要調控基因，其中Bcl-2 編碼蛋白屬于線粒體膜蛋白，是重要的抗凋亡基因，又稱為“生存基因”，表達水平與細胞壽命呈正相關。Bax 是促凋亡基因，Bax可促使細胞器釋放出某些信號分子，在這些信號分子作用下半胱氨酸蛋白酶活化，進而拮抗Bcl-2 的抗凋亡效應而使細胞趨于凋亡，或者作用于線粒體膜，降低線粒體膜電位，使線粒體通透性轉變孔(MPTP)開放，線粒體膨脹，使細胞進入凋亡程序進而誘導細胞凋亡[9]。Bcl-2 和Bax可以形成異源二聚體，也可各自形成同源二聚體。Bcl-2與Bax的比例是決定細胞命運的一個關鍵因素，比值增大有利于提高細胞的存活能力，反之則促進細胞死亡[10]。Yang等[11]研究老年癡呆大鼠認知功能受損機制時發現認知功能受損大鼠海馬神經元促凋亡蛋白Bid、Bax，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，神經元受損和死亡與激活細胞凋亡通路有關。凌云志等[8]研究發現老年大鼠在股骨頸骨折術后出現了短暫的認知功能障礙，海馬內Bcl-2 mRNA的表達量降低，Bax mRNA的表達量增高，Bcl-2 /Bax 比例降低。本研究結果發現模型組老年大鼠術后出現認知功能障礙，且抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，促凋亡蛋白Bax表達升高，提示術后認知功能障礙與海馬區抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，促凋亡蛋白Bax表達升高，激活細胞凋亡通路有關。

研究表明星狀神經節阻滯可引起腦組織Bcl-2 表達增強，Bax表達減弱[12-13]。提示星狀神經節阻滯可能通過增加海馬神經元Bcl-2表達，降低Bax 表達，抑制神經元凋亡，減輕術后認知功能障礙。為了驗證這個假說，本研究采用麻醉下對老年大鼠進行剖腹探查術建立老年患者術后認知功能障礙大鼠模型，并于手術前對大鼠進行星狀神經節阻滯明確星狀神經節阻滯在改善老年患者術后認知功能障的作用。采用行為學測試觀察老年大鼠術后認知功能；采用TUNEL法觀察海馬區細胞凋亡情況；采用免疫組化法觀察大鼠海馬神經凋亡相關基因Bcl-2、Bax蛋白表達情況。本研究結果顯示星狀神經節阻滯增加海馬神經元Bcl-2表達，降低Bax 表達，抑制神經元凋亡，減輕術后認知功能障礙。

綜上所述，星狀神經節阻滯可通過調控海馬區Bcl-2、Bax的表達，減少海馬神經元的凋亡，改善老年大鼠術后認知功能。我們的研究結果將為今后臨床改善老年患者術后認知功能障提供新的線索和方法。