TGFβ-SMAD通路基因多態性與鼻咽癌預后相關性研究

張 璇，朱海龍，哈敏文

錦州醫科大學附屬第一醫院腫瘤科(錦州 121000)

鼻咽癌是最為常見的頭頸部惡性腫瘤之一，目前對其治療以放射治療聯合化療為主[1-3]。鼻咽癌患者治療后遠處轉移率高達20%～30%[4]。隨著研究的不斷深入，發現個體遺傳因素在預后差異中起著關鍵作用[5-6]，個體在藥物反應、藥物毒性和癌結局等差異較大[7-8]。單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism,SNP)屬于個體遺傳因素差異的一個重要標志，目前有很多研究對單核苷酸多態性與鼻咽癌易感性的關聯性進行了研究，也有許多易感位點被發現[9]。轉化生長因子 β(Transforming growth factor-beta，TGF-β)信號通路與多種惡性腫瘤的發生、增殖、侵襲以及轉移有相關性[10]。本研究分析其與鼻咽癌患者治療后3年轉移風險的相關性，為臨床診治提供理論依據。

對象與方法

1 研究對象 選擇296例鼻咽癌患者為研究對象，296例患者平均年齡(45.12±8.71)歲，其中男性、女性患者分別為214例、82例；臨床分期為Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期的患者數分別為11例、50例、96例、139例；入組條件：經病理首次確診的鼻咽癌患者；患者未發生遠處轉移；行根治性調強放射治療者；臨床資料完整者。排除入組前合并其他惡性腫瘤患者。

2 治療方法 I期鼻咽癌患者僅采取放射治療，II期、III期、IV期鼻咽癌患者在化療的基礎上聯合放射治療。入組的296例鼻咽癌患者中，接受化療與未接受化療的患者分別為278例、18例，18例未接受化療的患者包含11例I期患者以及7例化療不耐受患者。278例接受化療的鼻咽癌患者包含誘導化療聯合同步化療聯合輔助化療患者94例，誘導化療聯合輔助化療患者40例，誘導化療聯合同步化療患者84例，單純誘導化療患者40例，單純同步化療患者17例，單純輔助化療3例。

3 SNP位點的選擇 本研究采用Haploview 軟件對美國國家生物技術信息中心的基因數據庫中全部TGF-β/Smad信號通路中主要分子基因的SNP位點進行篩選，共選取TGF-β1基因(rs4803455、rs1800469、rs1800470)、TGFβR1基因(rs11568753)、SMAD3基因(rs6494633、rs11071938、rs11632964)、SMAD4基因(rs12958604、rs12456284)、SMAD6基因(rs12913975、rs12906898、rs4776318)，共計12個SNP位點。

4 基因分型 抽取受試者全血置入肝素抗凝管中，嚴格按照試劑盒說明提取全血DNA(QIAGEN )并以瓊脂糖凝膠電泳質檢，將合格的DNA樣本保存于-20℃冰箱中備用。本實驗采用Sequenom Mass ARRAY 法對樣本進行SNP基因分型。首先通過Sequenom公司的Genotyping tools軟件進行引物設計(表1)，進行PCR擴增、單堿基延伸反應。最后通過基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜技術對樹脂純化后的延伸產物芯片進行檢測，以TYPE4.0軟件進行分型。

表1 12個SNP位點引物序列

5 隨訪調查 放療結束后兩年內，門診醫生進行每5個月一次的隨訪；放療結束后第3～5年進行每半年一次的隨訪，放療后5年，進行每年一次隨訪。治療后，每半年進行一次磁共振檢查(鼻咽、頸部)以及全身放射性骨掃描。

結 果

1 一般資料、病理學特征與預后情況的相關性分析 296例受試者進行隨訪發現，患者的3年無遠處轉移生存率以及總生存率分別為84.80%(251例)、91.55%(271例)。預后分析顯示，鼻咽癌患者N分期不同，3年無遠處轉移生存率以及3年總生存率不同(P<0.05)，而患者年齡、性別、T分期、臨床分期、是否接受化療以及化療周期的不同，3年無遠處轉移生存率以及3年總生存率無區別(P>0.05)。Cox回歸分析結果顯示，N分期可作為鼻咽癌患者3年無遠處轉移生存及3年總生存情況的獨立預測因素(P<0.05)。綜合預后分析及Cox回歸分析表明，患者年齡、性別、T分期、化療周期與鼻咽癌患者3年無遠處轉移生存及3年總生存情況間有關聯性(P>0.05)。見表2、3。

2 聯合分析 同時攜帶三種“不利”基因型的鼻咽癌患者3年無遠處轉移生存率低于同時攜帶1/2種“不利”基因型的患者(P<0.05)。同時攜帶三種“不利”基因型的鼻咽癌患者3年遠處轉移風險約為不攜帶不利基因型患者的5.937倍，同時攜帶兩種“不利”基因型的鼻咽癌患者3年遠處轉移風險約為不攜帶不利基因型患者的2.469倍。見表4。

3 SNP位點基因型與鼻咽癌患者3年無遠處轉移生存率的相關性分析 單因素分析顯示，TGF-β1基因rs1800469位點CC基因型攜帶者3年無遠處轉移生存率低于CT/TT基因型攜帶者(73.85% 與 87.88%)(P<0.05)；TGF-β1基因rs1800470位點CC基因型攜帶者3年無遠處轉移生存率高于CT/TT基因型攜帶者(87.77% 與 71.64%)(P<0.05)；SMAD4基因rs12958604位點AA基因型攜帶者3年無遠處轉移生存率高于AG/GG基因型攜帶者(87.93%與 81.67%)(P<0.05)。未見其余SNP 位點基因型與鼻咽癌患者3年無遠處轉移情況間的相關性(P>0.05)。多因素分析顯示，TGF-β1基因rs1800469位點TC/TT基因型攜帶者3年無遠處轉移風險約為CC基因型攜帶者的0.541倍、TGF-β1基因rs1800470位點TC/TT基因型攜帶者3年無遠處轉移風險約為CC基因型攜帶者的2.322倍、SMAD4基因rs12958604位點AG/GG基因型攜帶者3年無遠處轉移風險約為AA基因型攜帶者的2.357倍(P<0.05)。見表5。

表2 鼻咽癌患者一般資料、病理學特征與預后分析(n=296)

表3 一般資料、病理學特征與患者3年無轉移生存率及總生存率多因素Cox回歸分析

4 SNP位點基因型與鼻咽癌患者3年總生存率的相關性分析 單因素分析顯示，TGF-β1基因rs1800469位點CC基因型攜帶者3年總生存率低于CT/TT基因型攜帶者(81.54% 與 93.51%)(P<0.05)，未見其余SNP位點基因型與鼻咽癌患者3年總生存情況間的相關性(P>0.05)。多因素分析顯示，TGF-β1基因rs1800469位點TC/TT基因型攜帶者3年死亡風險約為CC基因型攜帶者的0.455倍(P<0.05)。見表6。

表4 不利基因型數目與3年無遠處轉移生存率Cox 多因素分析

表5 SNP位點基因型與鼻咽癌患者3年無遠處轉移生存率的相關性分析

表6 SNP位點基因型與鼻咽癌患者3年總生存率相關性分析

討 論

鼻咽癌患者的治療方式主要包括使用調強放射治療以及同步化療[11]，而遠處轉移是鼻咽癌患者治療失敗的主要因素[12]。研究人員將鼻咽癌治療的研究重點集中在降低其治療后遠處轉移的發生率上[13-14]。隨著研究深入，SNP位點基因型與多種疾病的發生發展以及預后密切相關[15]。本研究對鼻咽癌患者TGF-β/Smad 信號通路中的重要基因的12個SNP位點的基因型進行分析，發現rs1800470位點TT型基因患者與CT/TT型患者相比，遠處轉移風險要高，這一研究結果與之前研究結果相似。本研究發現，SMAD4基因rs12958604位點不同基因型鼻咽癌患者3年遠處轉移風險存在統計學差異，其中AG/GG基因型攜帶者3年無遠處轉移風險約為AA基因型攜帶者的2.357倍。隨著人們對疾病個體性差異和單核苷酸多態性的研究不斷深入，很多學者也發現鼻咽癌預后與SNP位點可能有關聯性。本研究表明3個SNP位點與鼻咽癌轉移風險存在相關性。由于信號通路是十分復雜的，故而提示僅通過單個SNP位點基因型對預測預后的效果可能不佳，而聯合聯測同一通路上重要基因的多個SNP位點可能有利于提高預測能力。本研究發現TGF-β/Smad信號通路上的多個基因變異有疊加反應。另外在臨床上對這種遠處轉移風險預測有重要的作用，能夠更好地對高轉移風險患者進行篩查，并及時給予治療來減少遠處轉移。本研究平均隨訪時間為39.5個月，而所有患者的3年無轉移生存率為84.80%，3年總生存率為91.55%。

綜上所述，鼻咽癌患者中，TGF-β1基因rs1800469位點CC 基因型、rs1800470位點TT基因型以及SMAD4基因rs12598604位點AG/GG型攜帶者3年遠處轉移風險較高，TGF-β1基因rs1800469位點CC基因型攜帶者3年總生存率較低，可通過聯合分析上述位點對鼻咽癌患者預后情況進行預測。