鴉膽子素D對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖與凋亡及細胞周期的影響*

張 賀，姜大慶

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院2017級碩士研究生 (沈陽 110167)；2.遼寧省腫瘤醫(yī)院乳腺外科(沈陽 110042)

乳腺癌作為女性最常見的癌癥診斷及死因，其發(fā)病率已占全球癌癥新發(fā)病例的11.6%[1-3]。鴉膽子，又稱苦參子、老鴉膽，為苦木科植物鴉膽子[Brucea javanica (L.)Merr.]的干燥成熟果實，為治療癌癥常用中藥材。鴉膽子素D(Bruceine D，BD)是從中藥鴉膽子中分離提取的一種水溶性三環(huán)四萜類化合物。已有證據(jù)表明BD在肝癌、胰腺癌及慢性粒細胞白血病中有抑制癌細胞增殖的作用,BD通過調(diào)節(jié)microRNA-95發(fā)揮其對HCC的抗癌活性，通過p38-MAPK及NF-kB途徑促進胰腺癌凋亡[4-5]。Zhang JY等亦發(fā)現(xiàn)BD可通過線粒體途徑誘導(dǎo)白血病K562細胞凋亡[6]。但其對乳腺癌的影響尚未報道，故本實驗研究其對MDA-MB-231細胞株抗癌活性，并探討其可能機制及通路，以期為乳腺癌開發(fā)新藥提供思路。

材料與方法

1 試 劑 人乳腺癌細胞株MDA-MB-231購自中科院上海細胞庫。鴉膽子素D(CAS:21499-66-1，20mg，HPLC≥98%，貨號：B21415)購自上海源葉生物科技有限公司。1640培養(yǎng)液(RPMI 1640)、DMEM培養(yǎng)液購于Hyclone公司；胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)、PBS(磷酸鹽緩沖液)購于Genvew公司；胎牛血清(FBS)購于Clark公司；CCK-8試劑購于Vazyme公司；碘化丙錠溶液購于北京鼎國盛生物技術(shù)有限公司；凋亡試劑盒購于碧云天有限公司、RIPA裂解液購于中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

2 儀 器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo-371，德國 Thermo scientific 公司)、超凈臺(DL-CJ-2N，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、熒光顯微鏡(LeicaDMi8，德國Leica公司)、離心機(Centrifμge 5804R，德國 Eppendorf 公司)、流式細胞儀(FACSAriall，美國BD公司)。

3 方 法

3.1 溶藥：BD用DMSO溶解后，配成20 mmol/L的母液分裝，置于-20℃冰箱冷藏備用。

3.2 細胞培養(yǎng)： MDA-MB-231細胞株置于含10%胎牛血清、1×108U/L青霉素、100 g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2的恒溫細胞孵育箱中連續(xù)培養(yǎng)。每2～3天胰酶消化傳代。

3.3 CCK8法檢測細胞活性： 取對數(shù)生長期MDA-MB-231細胞，按6000個/孔鋪96孔板，3個板均孵育24 h。 母液稀釋配藥，不同濃度BD(0、3、5、10、30、50 μmol/L)，每組5個復(fù)孔加藥。標(biāo)記號碼及時間，分別孵育24、48、72 h。 每孔加10 μl CCK-8，37 ℃孵育4 h酶標(biāo)儀檢測，波長在450 nm測各孔吸光度值，實驗重復(fù)3次，計算IC50。

3.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡：取對數(shù)生長期MDA-MB-231細胞，按1.5× 105個/孔接種至六孔板，孵育24 h。根據(jù)上述IC50值(28 μmol/L)，加入(0、10、30、50 μmol/L)的BD，作用24 h后消化離心，預(yù)冷PBS沖洗后，100 μl 1×緩沖液重懸細胞。 蒸餾水按4∶1比例稀釋5× Annexin V結(jié)合緩沖液，用1×結(jié)合緩沖液10∶1比例稀釋PI。 每管加入3 μl的FITC-Annexin V和2 μl的PI，室溫避光孵育15 min。 每管加400 μl的1×結(jié)合緩沖液，流式細胞儀檢測，F(xiàn)lowJo V10軟性分析，實驗重復(fù)3次，計算細胞凋亡率。

3.5 流式細胞儀檢測細胞周期：取對數(shù)生長期MDA-MB-231細胞，按1.5× 105個/孔接種至六孔板，設(shè)置空白對照組，PI陰性對照組，0、10、30、50 μmol/L的BD組，孵育24 h。 加入1 ml冰浴預(yù)冷的70%乙醇，4℃固定12 h。 每管加入0.5 ml碘化丙啶染色液，37 ℃避光溫浴30 min后4 ℃冰浴避光存放，流式細胞儀檢測，CellQuest軟件分析結(jié)果。實驗重復(fù)3次。

4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理實驗數(shù)據(jù)，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度鴉膽子素D對乳腺癌細胞增殖的影響 不同濃度BD(0、3、5、10、30、50 μmol/L)分別作用24、48、72 h后MDA-MB-231細胞存活率如表1所示。可見相同時間隨藥物濃度增加，細胞存活率降低；且相同濃度隨作用時間增加，細胞存活率降低。24、48及72 h的IC50值分別為28、13、7 μmol/L即BD抑制乳腺癌細胞增殖呈時間劑量依賴性，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 不同濃度鴉膽子素D對乳腺癌細胞增殖的影響

注：與對照組0 μmol/L相比，各項均P<0.05

2 不同濃度鴉膽子素D對乳腺癌細胞凋亡的影響 采用含0、10、30、50 μmol/L的BD處理MDA-MA-231細胞24 h后，如表2所示。總細胞群中凋亡細胞的百分比分別為6.69%、15.12%、35.83%和40.67%，與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明BD劑量依賴性的誘導(dǎo)MBA-MB-231細胞凋亡。

表2 不同濃度鴉膽子素D對乳腺癌細胞凋亡的影響

注：與對照組0 μmol/L相比，各項均P<0.05

3 不同濃度鴉膽子素D對乳腺癌細胞周期的影響 用含0、10、30、50 μmol/L的BD處理MDA-MA-231細胞24 h后，流式細胞儀分析檢測其各周期占比。如表3所示，BD以劑量依賴性誘導(dǎo)G0/G1期的MDA-MA-231細胞的百分比增加，經(jīng)0、10、30、50 μmol/L的BD作用24 h后，G0/G1期的乳腺癌細胞占比分別為31.45%、40.93%、 57.16%、 66.38%。可見隨藥物濃度增加，處于G0/G1期的細胞比例逐漸增加，G2/M期的細胞比例下降，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 不同濃度鴉膽子素D對乳腺癌細胞周期的影響

注：與對照組0 μmol/L相比，各項均P<0.05

討 論

鴉膽子首載于清代醫(yī)學(xué)家趙學(xué)敏的《本草綱目拾遺》中，具有清熱解毒，殺蟲截瘧的功效。現(xiàn)代鴉膽子主要用于抗腫瘤、增強免疫、抗瘧等領(lǐng)域。南新記等研究發(fā)現(xiàn)鴉膽子油注射液對激素抵抗性前列腺癌VEGF C及血清PSA水平均有明顯影響，且顯著降低其化療后不良反應(yīng)[7]。王立軍等在鴉膽子甲醇提取物中分離出11種化合物，其中鴉膽子內(nèi)酯A和鴉膽子素D對癌細胞株有明顯抗癌作用[8]。Liu等發(fā)現(xiàn)BD在胰腺癌中對Panc-1、SW1990及Capan-1等多種細胞系均存在很強的細胞毒作用,且其研究表明BD的抗增殖作用與吉西他濱及喜樹堿相當(dāng)，BD以劑量依賴性增加subG1期的Capan-2細胞百分比，表明BD通過線粒體途徑誘導(dǎo)胰腺癌細胞凋亡[9]。Cheng等研究發(fā)現(xiàn)BD顯著抑制肝腫瘤細胞生長并增強索拉菲尼在大鼠HCC中的治療效果，其機制為BD促進β-連環(huán)蛋白的蛋白酶體降解和其核積累的消耗，反過來破壞HCC中Notch配體Jagged1的Wnt/β-連環(huán)蛋白依賴性轉(zhuǎn)錄[10]。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)鴉膽子素D可抑制HPV 16 E6、HPV 16 E7 mRNA的表達，抑制HPV 16細胞增殖，BD誘導(dǎo)癌細胞凋亡的機制與JNK蛋白相關(guān)[11-13]。安改麗等研究發(fā)現(xiàn)miR-145可通過抑制Bcl-2和P-gp蛋白的表達來增加MCF-7/ADR細胞對阿霉素的敏感性和凋亡[14]。

已知細胞凋亡是細胞生長抑制的主要途徑，其涉及一系列基因的激活、表達與調(diào)控。在哺乳動物細胞中，導(dǎo)致細胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)分兩大類，即內(nèi)源性途徑和外源性途徑。內(nèi)源性途徑亦稱為線粒體途徑，包括線粒體在執(zhí)行凋亡程序的半胱天冬酶級聯(lián)起始中的作用[15]。本研究闡明BD誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞凋亡是其抑制乳腺癌細胞生長的主要機制，后續(xù)實驗室將進一步明確BD促進乳腺癌細胞凋亡的具體機制。