林元益陽(yáng)膠囊對(duì)小鼠補(bǔ)腎益陽(yáng)作用的實(shí)驗(yàn)研究

姜姍姍，石敏娟，惠愛武，楊 潔， 趙 崗，張曉鳳，袁秋貞

陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安 710003)

林元益陽(yáng)膠囊來(lái)源于臨床經(jīng)驗(yàn)方，驗(yàn)之臨床取得了很好療效。其功能為補(bǔ)腎益陽(yáng)，生精填髓。主治腎陽(yáng)不足，男子精液稀薄，經(jīng)久不育。為探索本方的作用機(jī)理，本研究建立了小鼠腎陽(yáng)虛模型。觀察林元益陽(yáng)膠囊對(duì)腎陽(yáng)虛模型小鼠的影響，及其對(duì)正常雄性小鼠交配能力和精子數(shù)的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證其藥理作用，為本品臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1 主要儀器 YP1201N電子天平(上海精密儀器有限公司)；AL104型萬(wàn)分之一分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；MC-106B電子體溫計(jì)(歐姆龍工貿(mào)大連有限公司)；YLS-1A多功能小鼠自主活動(dòng)記錄儀(濟(jì)南益燕科技發(fā)展有限公司)；計(jì)時(shí)秒表(中國(guó)卡西歐有限責(zé)任公司)；紅外攝像機(jī)(臺(tái)灣多安科技有限公司)；iMark酶標(biāo)儀(Bole Life Medical Products Co.，Ltd)；E200光學(xué)顯微鏡(日本尼康儀器有限公司)。

2 藥品與試劑 林元益陽(yáng)膠囊(批號(hào)：160420)西安雁塔藻露堂中醫(yī)院提供。甲睪酮片(國(guó)藥準(zhǔn)字H31020637)購(gòu)自上海信宜康捷藥業(yè)有限公司。氫化可的松注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字H61021633)購(gòu)自西安利君制藥有限公司。己烯雌酚片(國(guó)藥準(zhǔn)字H34021250)購(gòu)自合肥久聯(lián)制藥有限公司。環(huán)磷酸腺苷，環(huán)磷酸鳥苷酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(批號(hào)為：20170309100723，20170309100724，20170309100725)購(gòu)自上海騫億生物科技有限公司。

3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)KM小鼠，體重18～22 g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào)：SCXK(陜)2012-003。

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1 對(duì)腎陽(yáng)虛模型小鼠的作用

4.1.1 造模與給藥：雄性小鼠60只，隨機(jī)分為6組。正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，甲睪酮片組，林元益陽(yáng)膠囊大、中、小劑量組，每組10只。正常對(duì)照組肌肉注射0.9%氯化鈉注射液，其余各組肌肉注射氫化可的松25 mg/kg，1次/d，連續(xù)14 d，制備腎陽(yáng)虛模型[1]。灌胃給藥于第15天開始，1次/d。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予10 ml/kg去離子水；陽(yáng)性對(duì)照組給予1 mg / kg甲基睪酮片； 林元益陽(yáng)膠囊大、中、小劑量組分別給予2.775、1.388、0.694 g/ kg的藥物，1次/d，連續(xù)14 d。

4.1.2 動(dòng)物一般體征的觀察：觀察各組小鼠的體重，肛溫等一般身體狀況及小鼠自主活動(dòng)情況。小鼠自主活動(dòng)的測(cè)試：最后一次給藥后1 h后，將小鼠置于自主活動(dòng)記錄儀中安靜適應(yīng)5 min后，測(cè)量10 min內(nèi)小鼠的自發(fā)活動(dòng)次數(shù)。

4.1.3 指標(biāo)檢測(cè)：于小鼠自主活動(dòng)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用乙醚麻醉實(shí)驗(yàn)小鼠，打開腹腔，腹主動(dòng)脈進(jìn)行取血，稱重小鼠睪丸、附睪、精囊和前列腺，并計(jì)算臟器系數(shù)，臟器系數(shù)=臟器濕重(g)/體重(g)×1000。通過(guò)3500 r/min離心10 min分離血清，并且根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒的說(shuō)明測(cè)量環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)含量，并計(jì)算cAMP / cGMP值[2]。

4.2 對(duì)正常小鼠交配能力和精子的影響[3]

4.2.1 分組及給藥:按交配能力將60只18～22 g的雄性小鼠隨機(jī)分成5組。正常對(duì)照組，甲睪酮片組，林元益陽(yáng)膠囊大、中、小劑量組，每組12只。 正常對(duì)照組給予10 ml/kg去離子水灌胃；陽(yáng)性對(duì)照組給予1 mg/kg甲基睪酮片灌胃；林元益陽(yáng)膠囊大、中小劑量組分別以2.775 g/kg，1.388 g/kg和0.694 g/kg的劑量灌胃給藥。1次/d，連續(xù)14 d。

4.2.2 交配能力檢測(cè)：取70只18～22 g的雌性小鼠，于交配實(shí)驗(yàn)開始前3天給每只雌鼠灌胃0.4 mg/kg的己烯雌酚懸浮液，1次/d，將發(fā)情時(shí)間與交配時(shí)間同步。在最后一次給藥后，選擇進(jìn)入發(fā)情期的雌性小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。夜間進(jìn)行交配實(shí)驗(yàn)，每籠放入一只雄鼠適應(yīng)環(huán)境5 min，然后放入一只雌性小鼠。用紅外攝像機(jī)記錄捕捉潛伏期(自雌鼠投入到第一次雄鼠捕捉雌鼠的時(shí)間)及捕捉次數(shù)(自雌鼠投入20 min內(nèi)雄鼠捕捉雌鼠的次數(shù))。

4.2.3 對(duì)正常小鼠精子的影響[4]：在交配實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后，分離取出右側(cè)附睪，將其裝入1 ml無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(0.15 mmol/ L， pH7.2)中剪碎，反復(fù)洗滌，37°C下孵育30 min，即為附睪精子懸液。移取一滴精子到載玻片上，立即在顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)200個(gè)精子中的活精子數(shù)，計(jì)算活率。同時(shí)，將20 μl精子懸浮液加入到0.38 ml(20倍稀釋)精子固定液中，搖勻，然后用滴管吸出。填充到白細(xì)胞計(jì)數(shù)池中，通過(guò)白細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)精子。

結(jié) 果

1 動(dòng)物的一般狀態(tài)觀察 與其他各組相比，正常對(duì)照組小鼠體形偏大，被毛光滑干爽，精神狀態(tài)佳。造模后，小鼠體重減輕，被毛凌亂少澤，反應(yīng)遲緩，肢涼尾冷，喜弓背蜷縮，少食少飲，與臨床腎陽(yáng)虛癥狀相似。用藥后，上述腎陽(yáng)虛癥狀均得到明顯的緩解。

造模后，各組小鼠體重明顯低于正常對(duì)照組(P<0.01)。經(jīng)藥物治療后，甲睪酮片和林元益陽(yáng)膠囊大劑量組的體重明顯高于模型對(duì)照組(P<0.05)。各組體重變化見表1。

2 林元益陽(yáng)膠囊對(duì)模型小鼠自主活動(dòng)的影響 見表2。腎陽(yáng)虛模型組小鼠自發(fā)活動(dòng)次數(shù)明顯低于正常對(duì)照組(P<0.01)。林元益陽(yáng)膠囊大，中劑量組小鼠自發(fā)活動(dòng)次數(shù)明顯高于模型對(duì)照組(分別為P<0.05、P<0.01、P<0.05)。

3 林元益陽(yáng)膠囊對(duì)腎陽(yáng)虛小鼠體溫的影響 見表3。在造模前，造模的第14天和給藥的第14天，用電子體溫計(jì)測(cè)量體溫，模型對(duì)照組小鼠的肛溫顯著降低。經(jīng)藥物干預(yù)后，甲睪酮片、林元益陽(yáng)膠囊大劑量組小鼠肛溫明顯高于模型對(duì)照組(P<0.05)。提示其可明顯升高腎陽(yáng)虛小鼠體溫。

表1 林元益陽(yáng)膠囊對(duì)各組模型小鼠體重的影響(g)

注：與正常對(duì)照組比較,▲P<0.01;與模型對(duì)照組比較,*P<0.05

表2 林元益陽(yáng)膠囊對(duì)各組模型小鼠自主活動(dòng)的影響(次/10 min)

注：與正常對(duì)照組比較,△P<0.05;與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，◇P<0.01

4 林元益陽(yáng)膠囊對(duì)模型小鼠臟器指數(shù)的影響 見表4。與正常對(duì)照組相比，腎陽(yáng)虛模型組小鼠的睪丸及附睪指數(shù)顯著降低(P<0.05)。甲基睪酮片組(P<0.01)、林元益陽(yáng)膠囊大(P<0.01)、中(P<0.01)、小(P<0.05)劑量組能顯著增加模型小鼠的睪丸指數(shù)。林元益陽(yáng)膠囊大、中劑量組和甲睪酮片組使陽(yáng)虛小鼠附睪指數(shù)顯著升高(分別為P<0.01、P<0.05、P<0.01)。

表3 林元益陽(yáng)膠囊對(duì)各組腎陽(yáng)虛模型小鼠體溫的影響(℃)

注：與正常對(duì)照組比較,△P<0.05，▲P<0.01;與模型對(duì)照組比較,*P<0.05

表4 林元益陽(yáng)膠囊對(duì)各組模型小鼠生殖器官指數(shù)的影響(mg/g)

注：與正常對(duì)照組比較,△P<0.05;與模型對(duì)照組比較,*P<0.05，◇P<0.01

5 林元益陽(yáng)膠囊對(duì)模型小鼠血清cAMP/cGMP值的影響 見表5。模型對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，血清cAMP顯著降低(P<0.01)，cGMP顯著升高(P<0.01)，cAMP/ cGMP值明顯減小(P<0.01)；甲睪酮片和林元益陽(yáng)膠囊高劑量組與模型對(duì)照組相比，cAMP顯著增加(分別為P<0.05和P<0.01)。甲睪酮片組、林元益陽(yáng)膠囊組與模型對(duì)照組相比，cGMP水平顯著降低(P<0.01)。甲睪酮片組、林元益陽(yáng)膠囊大、中劑量組與模型對(duì)照組相比，cAMP/cGMP值明顯增加(P<0.01)，林元益陽(yáng)膠囊小劑量組顯著增加(P<0.05)。與正常對(duì)照組相比，甲睪酮片組與林元益陽(yáng)膠囊大劑量組的cAMP/cGMP值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表5 林元益陽(yáng)膠囊對(duì)各組模型小鼠血清cAMP、cGMP及其比值的影響

注：與正常對(duì)照組比較,△P<0.05，▲P<0.01;與模型對(duì)照組比較,*P<0.05，◇P<0.01

6 林元益陽(yáng)膠囊對(duì)正常小鼠交配能力的影響 見表6。與正常組相比，甲基睪酮片組小鼠捕捉潛伏期顯著縮短，次數(shù)明顯增加(P<0.01)；與正常組相比，林元益陽(yáng)膠囊各劑量組小鼠的捕捉潛伏期縮短，其中大劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，林元益陽(yáng)膠囊大、中劑量組也可以提高捕捉次數(shù)及捕捉率，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表6 林元益陽(yáng)膠囊對(duì)各組正常小鼠交配能力的影響

注：與正常對(duì)照組比較,*P<0.05，◇P<0.01

7 林元益陽(yáng)膠囊對(duì)正常雄性小鼠精子的影響 結(jié)果表明，林元益陽(yáng)大、中、小劑量組和甲睪酮片顯著增加了小鼠附睪精子的數(shù)量(P<0.01)。精子存活率明顯提高(林元益陽(yáng)小劑量組P<0.05，其他組P<0.01)。

表7 林元益陽(yáng)膠囊對(duì)各組正常雄性小鼠精子的影響

注:與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，◇P<0.01

以上研究提示，林元益陽(yáng)膠囊能顯著改善腎陽(yáng)虛小鼠的腎陽(yáng)虛狀態(tài)，并能顯著增加陽(yáng)虛小鼠的體重、體溫和自發(fā)活動(dòng)次數(shù)。它可以顯著提高腎陽(yáng)虛模型小鼠的睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)，提示該藥品對(duì)由氫化可的松引起的性器官萎縮有明顯的保護(hù)作用。正常雄性小鼠應(yīng)用林元益陽(yáng)膠囊干預(yù)14 d后，附睪精子數(shù)量顯著增加，精子存活率顯著提高。

討 論

祖國(guó)醫(yī)學(xué)稱腎為“先天之本”，藏先天之精，主生殖。腎陽(yáng)虛為體內(nèi)腎陽(yáng)不足，溫煦、推動(dòng)、興奮功能減退，臨床以肢冷、畏寒、腰膝酸軟、陽(yáng)痿早泄等為主要表現(xiàn)的證候[5]。

現(xiàn)代研究證實(shí)，“腎陽(yáng)虛”與下丘腦 - 垂體 - 腎上腺軸，甲狀腺軸和性腺軸的紊亂關(guān)系密切[6]。在該實(shí)驗(yàn)中，肌肉注射外源性糖皮質(zhì)激素氫化可的松復(fù)制腎陽(yáng)虛小鼠模型[7]。造模后，小鼠表現(xiàn)出體重和體溫下降，被毛疏松，精神倦怠，弓背蜷縮，肢涼尾冷，大便溏泄，自主活動(dòng)減少等明顯的“陽(yáng)虛體征”。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，林元益陽(yáng)膠囊可以改善外源性糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的腎陽(yáng)虛癥狀，增加模型小鼠體重和自主活動(dòng)次數(shù)、升高肛溫。

機(jī)體多種生理、病理過(guò)程都有第二信使的參與，其中環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)[8]。 生物學(xué)家Goldberg[9]認(rèn)為cAMP和cGMP參與細(xì)胞反應(yīng)的調(diào)節(jié)，并且通常具有拮抗作用，這種拮抗調(diào)節(jié)作用可用“陰”和“陽(yáng)”來(lái)概括。在此基礎(chǔ)上，提出了生物控制二元論，即陰陽(yáng)學(xué)說(shuō)。 cAMP和cGMP的相對(duì)平衡有益于維持機(jī)體的穩(wěn)定生理狀態(tài)[10]。在該實(shí)驗(yàn)中，模型對(duì)照組的 cAMP顯著降低， cGMP顯著增加，并且 cAMP/ cGMP顯著降低， 表明環(huán)核苷酸系統(tǒng)在具有腎陽(yáng)虛癥狀的小鼠中體內(nèi)的反應(yīng)性是失衡的，也是腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)受到抑制的另一種表現(xiàn)。 從中醫(yī)角度來(lái)講是由于腎的陽(yáng)氣不足導(dǎo)致推動(dòng)、溫煦各個(gè)組織器官的動(dòng)力減弱，不能進(jìn)行溫養(yǎng)腎氣的作用，從而引起的細(xì)胞代謝功能的紊亂。 給予林元益陽(yáng)膠囊后，血清cGMP含量顯著降低，cAMP/cGMP比值顯著升高，提示林元益陽(yáng)膠囊可以改善機(jī)體能量代謝的紊亂低下狀態(tài)。

中醫(yī)認(rèn)為，腎主生殖，人體生殖功能與腎氣盛衰密切相關(guān)。腎精不足，腎陽(yáng)虛衰會(huì)影響人的生殖功能，表現(xiàn)為陽(yáng)痿，早泄等性功能障礙的癥狀[11]。

性腺和性器官的發(fā)育和成熟具有維持第二性征和正常性功能的作用。一旦性腺組織萎縮或減輕，由其分泌的性激素量會(huì)明顯減少，導(dǎo)致性功能衰退或紊亂[12]。因此，動(dòng)物生殖器官重量的變化可以反映藥物對(duì)雄激素的影響[13]。結(jié)果顯示，氫化可的松造模的小鼠睪丸和附睪的器官指數(shù)降低。經(jīng)林元益陽(yáng)膠囊灌胃后，各劑量組小鼠睪丸器官指數(shù)增大，大、中劑量組附睪器官指數(shù)增大。

交配實(shí)驗(yàn)測(cè)量小鼠的捕捉潛伏期，捕捉次數(shù)，捕捉率和射精率。這些性功能的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)可以表明實(shí)驗(yàn)藥物是否具有改善動(dòng)物性功能的作用[14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，林元益陽(yáng)大劑量組的捕捉潛伏期明顯縮短。林元益陽(yáng)大、中劑量組的捕捉次數(shù)增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。精子密度也是評(píng)估生育能力的重要指標(biāo)[15]。正常小鼠灌胃給予林元益陽(yáng)膠囊14 d后，各劑量組小鼠的附睪精子數(shù)量均明顯增加，精子存活率有所提高。

綜上所述，林元益陽(yáng)膠囊能改善腎陽(yáng)虛模型小鼠腎陽(yáng)虛癥狀，增強(qiáng)正常小鼠的交配能力，具有補(bǔ)腎益陽(yáng)的功效。近年來(lái)研究表明，腎陽(yáng)虛證與細(xì)胞、體液、分子免疫等具有一定相關(guān)性[16]。本研究前期預(yù)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)林元益陽(yáng)膠囊能明顯改善小鼠胸腺萎縮情況，故此后將進(jìn)一步研究探討林元益陽(yáng)膠囊在免疫學(xué)方面對(duì)腎陽(yáng)虛的作用機(jī)理。