冠心蘇合制劑微生物限度檢查方法研究

程龍，陳霞

(成都市食品藥品檢驗研究院，四川 成都 610041)

冠心蘇合丸和冠心蘇合膠囊均由蘇合香、冰片、醋乳香、檀香和土木香制成，具有理氣、寬胸、止痛的功效，用于寒凝氣滯、心脈不通所致的胸痹，癥見胸悶、心前區疼痛；冠心病心絞痛見上述證候者[1]。二者均為口服給藥制劑，按照2015年版《中國藥典》四部非無菌藥品微生物限度標準規定，應對需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數、大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌和沙門菌等5項微生物指標加以控制[2]。由于其處方中冰片、乳香和蘇合香都有抗菌消炎的作用[3-5]，故進行微生物限度檢查時，應消除樣品的抑菌活性，建立一種可靠有效的，適用于本品的方法[6-7]。本文按照2015年版《中國藥典》非無菌產品微生物限度檢查法，對冠心蘇合制劑上述5項微生物指標的檢查方法加以驗證，以確保所用微生物限度檢查方法的科學性、準確性和完整性，并能通過該方法正確檢驗出制劑受污染的情況，保證藥品質量安全[8]。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

全自動微生物分析系統(Vitek 2 compact，生物梅里埃)；生物安全柜(BHC-1000ΙΙA/B3，蘇凈集團安泰公司)；隔水式恒溫培養箱(GHP-9270，上海一恒科學儀器有限公司)；生化培養箱(LRH-250，上海一恒科學儀器有限公司)；高壓滅菌鍋(HVA-110,HIRAYAMA)；微量移液槍(BRAND)等。

1.2 菌種

大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)631001]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、乙型副傷寒沙門菌[CMCC(B)50094]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]和黑曲霉[CMCC(F)98003]均來源于中國藥品生物制品檢定所，以上菌種均為第4代培養物。

1.3 培養基

胰酪大豆胨液體培養基(批號：160912)、胰酪大豆胨瓊脂培養基(批號：170321)、沙氏葡萄糖液體培養基(批號：150914)、沙氏葡萄糖瓊脂培養基(批號：1705042)、麥康凱液體培養基(批號：160801)、麥康凱瓊脂培養基(批號：1608303)、RV沙門增菌液體培養基(批號：151012)、腸道增菌液體培養基(批號：1702162)、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基(批號：1702142)、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基(批號：171011)和pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號：161130)均來自于北京三藥科技開發公司。

1.4 樣品

冠心蘇合膠囊(批號：171004，河北萬歲藥業有限公司)；冠心蘇合丸(批號：1706137，哈藥集團世一堂制藥廠)。

2 方法與結果

2.1 菌液制備

按照2015年版《中國藥典》制備上述菌種的菌懸液。

2.2 供試液制備

取樣品10 g，加胰酪大豆胨液體培養基90 mL，45 ℃水浴保溫，用勻漿儀混勻，得1∶10供試液，再10倍梯度稀釋得1∶100和1∶1 000供試液。

2.3 計數方法適用性試驗

2.3.1 試驗組

平皿法：取1∶10、1∶100和1∶1 000供試液10 mL至試管中，分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉，使每毫升供試液含菌量不大于100 cfu。取菌懸液1 mL至平皿，平行制備2個平皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基，培養計數。再從接種白色念珠菌和黑曲霉的供試液試管中，取懸液1 mL至平皿，平行制備2個平皿，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基，培養計數。

薄膜過濾法：取供試液1 mL，按薄膜過濾法過濾，用0.1%蛋白胨水溶液沖洗3次，每次100 mL。在最后一次沖洗液中分別加入小于100 cfu/mL的5種菌懸液，過濾。將過濾后的濾膜貼于瓊脂培養基平板表面，培養計數。

2.3.2 供試品組

除不加試驗菌外，其他同試驗組。

2.3.3 菌液組

分別取上述5種試驗菌懸液1 mL至平皿中，平行制備2個平皿，傾注相應的瓊脂培養基，培養計數。

2.3.4 回收率計算

冠心蘇合膠囊計數方法適用性試驗回收率見表1，冠心蘇合丸計數方法適用性試驗回收率見表2。

回收率(%)=(試驗組菌落數-供試品組菌落數)/菌液組菌落數×100%

2.4 控制菌檢查方法適用性試驗

2.4.1 大腸埃希菌

試驗組：取1∶10供試液10 mL及不超過100 cfu/mL的大腸埃希菌懸液1 mL加入到100 mL的胰酪大豆胨液體培養基中，33 ℃培養24 h。吸取1 mL培養物接種至100 mL 麥康凱液體培養基中，43 ℃培養24 h。取麥康凱液體培養物劃線接種于麥康凱瓊脂培養基平板上，33 ℃培養24 h，觀察是否有菌生長。挑取單菌落分離純化，經革蘭染色后用Vitek 2 compact進行生化鑒定。

表1冠心蘇合膠囊微生物計數方法適用性結果

方法供試液胰酪大豆胨瓊脂沙氏葡萄糖瓊脂金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉白色念珠菌黑曲霉平皿法1∶100.170.7800.970.820.791.001∶1000.800.9401.001.050.771.031∶1 0000.840.980.310.971.00——薄膜過濾法1∶1000.940.940.120.950.93——1∶1 0000.981.000.810.981.07——

表2冠心蘇合丸微生物計數方法適用性結果

方法供試液胰酪大豆胨瓊脂沙氏葡萄糖瓊脂金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉白色念珠菌黑曲霉平皿法1∶1001.0200.910.830.950.981∶1000.781.1000.970.901.031.071∶1 0000.981.100.111.021.00——薄膜過濾法1∶1000.940.970.060.980.93——1∶1 0001.020.970.941.020.98——

供試品對照組：除不加大腸埃希菌外，其他同試驗組。

陽性對照組：除不加供試液外，其他同試驗組。

陰性對照組：用10 mL胰酪大豆胨液體培養基代替供試液，同時不接種大腸埃希菌，其他同試驗組。

方法適用性結果見表3，常規法可用于檢查大腸埃希菌。

2.4.2 沙門菌

試驗組：取供試品10 g及不超過100 cfu/mL的乙型副傷寒沙門菌懸液1 mL到200 mL的胰酪大豆胨液體培養基中，33 ℃培養24 h。吸取0.1 mL培養物接種至10 mL RV沙門增菌液體培養基中，33 ℃培養24 h。取上述培養物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養基平板上，33 ℃培養24 h，觀察是否有典型菌落生長。挑取典型單菌落分離純化，經革蘭染色后用Vitek 2 compact進行生化鑒定。

供試品對照組：除不接種乙型副傷寒沙門菌外，其他同試驗組。

陽性對照組：除不加供試品外，其他同試驗組。

陰性對照組：用10 mL胰酪大豆胨液體培養基代替供試品，同時不接種乙型副傷寒沙門菌，其他同試驗組。

方法適用性結果見表3，常規法可用于檢查沙門菌。

2.4.3 耐膽鹽革蘭陰性菌

試驗組：取1:10供試液10 mL及不超過100 cfu/mL的大腸埃希菌懸液和銅綠假單胞菌懸液各1 mL加入到100 mL的腸道增菌液體培養基中，33 ℃培養24 h，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基平板上，33 ℃培養24 h，觀察是否有菌落生長。挑取典型單菌落分離純化，經革蘭染色后用Vitek 2 compact進行生化鑒定。

供試品對照組：除不接種上述兩種試驗菌外，其他同試驗組。

陽性對照組：除不加供試液外，其他同試驗組。

陰性對照組：用10 mL胰酪大豆胨液體培養基代替供試液，同時不接種兩種試驗菌，其他同試驗組。

方法適用性結果見表3，常規法可用于檢查耐膽鹽革蘭陰性菌。

表3控制菌檢查方法適用性檢查結果

劑型檢查項試驗組陽性對照組供試品對照組陰性對照組結論冠心蘇合膠囊大腸埃希菌檢出檢出未檢出未檢出方法可行沙門菌檢出檢出未檢出未檢出方法可行耐膽鹽革蘭陰性菌檢出檢出未檢出未檢出方法可行冠心蘇合丸大腸埃希菌檢出檢出未檢出未檢出方法可行沙門菌檢出檢出未檢出未檢出方法可行耐膽鹽革蘭陰性菌檢出檢出未檢出未檢出方法可行

3 討論

冠心蘇合膠囊和冠心蘇合丸對細菌具有一定的抑制作用[8]，由于二者的處方一致，其抑菌作用沒有顯著差異。在需氧菌計數方法試驗中，二者1∶10供試液對革蘭陰性菌如銅綠假單胞菌基本沒有抑制作用，但對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌抑制作用較強。當供試液稀釋至1∶100和1∶1 000時，仍對枯草芽孢桿菌有較強的抑制作用。使用薄膜過濾法處理時，1∶10供試液黏稠度較高，藥渣較多，難以通過濾膜，而1∶100供試液仍有較多的藥渣殘留在薄膜上，枯草芽孢桿菌的回收率仍不能達到50%，最后選用1∶1 000供試液采用薄膜過濾法才能消除樣品的抑菌活性，5種菌的回收率均超過50%。而在霉菌和酵母菌總數計數以及控制菌檢查試驗中，常規法既可達到要求。

冠心蘇合制劑中主要抑菌成分為乳香和冰片，其中乳香可抑制細菌生長，尤其對金黃色葡萄球菌有一定的抑菌作用[9-10]，對枯草芽孢桿菌也有較強的抑制做用，有研究表明需采用1∶500乳香供試液通過薄膜過濾法才能保證枯草芽孢桿菌的回收率[4]，這與本文的試驗結果相一致。另有研究表明冰片對表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌等革蘭陽性菌有一定抑制作用[11-12]，同時對白色念珠菌也有抑制作用[13]，但從本次白色念珠菌的回收試驗來看，未見本品對白色念珠菌有顯著抑制作用。

此前，曾有研究者按照2010年版《中國藥典》建立冠心蘇合膠囊微生物限度檢查的方法證，離心沉淀取上清按薄膜過濾法處理[8]。隨著中國藥典的日益完善，微生物限度檢查方法適用性試驗也有很大改變，首先從消除抑菌活性的方法來看，2015年版《中國藥典》標示的方法有稀釋法、中和法和薄膜過濾法，去掉了2010年版《中國藥典》中推薦的離心沉淀法[14-15]。另外一個很大改變是計數試驗中加菌時間點，從傾注平皿前加菌改為供試液中加菌，對于無抑菌作用的樣品來說，這兩種方法回收率差異不大，但對于有抑菌作用或有殺菌作用的樣品，兩種方法收率則有很大差異[16]。這兩點改變導致按2010年版《中國藥典》建立的方法未必能通過2015年版《中國藥典》的驗證。所以，各生產企業應與時俱進，及時進行方法適應學試驗，以準確檢查出藥品中微生物污染狀況，保證藥品質量安全可靠。