眼后節(jié)給藥屏障研究進(jìn)展

陳雪峰,梁麗娜

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy,DR）、視網(wǎng)膜色素變性（retinal pigmentosa,RP）、年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration,AMD）等視網(wǎng)膜疾病是常見(jiàn)的致盲性疾病，有報(bào)道顯示DR 和AMD 的發(fā)病率近年來(lái)增長(zhǎng)迅速[1-2]。藥物治療仍然是上述致盲性眼病的主要治療方法和研究趨勢(shì)，主要給藥途徑包括玻璃體腔注射、靜脈給藥、視網(wǎng)膜下注射、眼周注射、經(jīng)結(jié)膜給藥等，但由于眼內(nèi)存在復(fù)雜的生理和解剖屏障，導(dǎo)致藥物很難在視網(wǎng)膜達(dá)到有效劑量，從而影響了藥物的療效。近十年人們通過(guò)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)對(duì)眼后節(jié)的給藥屏障做了大量研究，希望能夠找到更有效的給藥方法。本文根據(jù)不同給藥途徑綜述如下。

1 玻璃體腔注射

玻璃體腔內(nèi)注射是抗VEGF（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體是目前最常用的給藥方法之一，其優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)在可以直接越過(guò)數(shù)個(gè)屏障、操作步驟簡(jiǎn)單及相對(duì)安全。基于這些優(yōu)勢(shì)，玻璃體腔注射作為許多新藥臨床試驗(yàn)的主要給藥途徑[3]。但藥物是否能在視網(wǎng)膜達(dá)到有效的治療劑量仍然取決于是否能通過(guò)玻璃體及內(nèi)界膜屏障[4]。

1.1 玻璃體的屏障作用

來(lái)自玻璃體屏障作用包括兩個(gè)方面：一是玻璃體本身結(jié)構(gòu)形成的靜態(tài)屏障，二是玻璃體流動(dòng)過(guò)程形成的動(dòng)態(tài)屏障（圖1）。

Sakamoto 等[5]發(fā)現(xiàn)玻璃體切割術(shù)后病毒載體通過(guò)玻璃體的作用增強(qiáng)了，提示玻璃體是藥物擴(kuò)散的解剖屏障。非病毒載體的滲透也受到玻璃體凝膠組織的阻礙[4]，研究發(fā)現(xiàn)載體所帶的電荷對(duì)擴(kuò)散作用有明顯影響，比如帶負(fù)電荷的納米材料比帶正電荷的更容易穿過(guò)玻璃體組織[6]。

關(guān)于粒子大小對(duì)穿透性的影響研究結(jié)果不太統(tǒng)一,Xu 等[7]估算牛眼玻璃體的間隙大約在（550±50）nm 左右，并證實(shí)了1 μm 大小的顆粒不能順利通過(guò)間隙。但與之相反,Martens 等[8]卻發(fā)現(xiàn)帶負(fù)電荷的1 μm 顆粒可以順利通過(guò)相同條件下的間隙。雖然研究結(jié)果不一致，但上述研究提示大多數(shù)分子及抗體可以通過(guò)玻璃體腔，比如用于基因治療的納米粒子大小多在10～500 nm 之間，因此玻璃體靜態(tài)屏障不是影響藥物擴(kuò)散的主要障礙。

玻璃體流動(dòng)形成的動(dòng)態(tài)屏障對(duì)擴(kuò)散性好的微小藥物影響很小，但對(duì)于大分子、擴(kuò)散性差的藥物有明顯的阻礙作用[9-11]。動(dòng)態(tài)屏障的形成一方面來(lái)自于玻璃體前后壓力差引起的玻璃體流動(dòng)，另一方面是由于眼球的運(yùn)動(dòng)所引起，后者對(duì)藥物擴(kuò)散的影響更難預(yù)測(cè)，目前的結(jié)果大多基于玻璃體替代物研究[12-13]。

1.2 內(nèi)界膜的屏障作用

現(xiàn)在有很多關(guān)于內(nèi)界膜（internal limiting membranes，ILM）在基因治療視網(wǎng)膜疾病過(guò)程中屏障作用的報(bào)道，Dalkara等[14]發(fā)現(xiàn)采用蛋白酶對(duì)小鼠ILM 進(jìn)行溫和的消化后，腺病毒相關(guān)血清轉(zhuǎn)運(yùn)率明顯提高。其他觀察也顯示與健康的ILM 相比，當(dāng)ILM 因視網(wǎng)膜疾病遭到破壞時(shí)，載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力得到很大改善[15-16]。在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，載體通過(guò)與ILM 上結(jié)合位點(diǎn)的相互作用增加其在玻璃體視網(wǎng)膜界面的累積，進(jìn)一步擴(kuò)散到視網(wǎng)膜進(jìn)行基因表達(dá)[14-15,17-19]。Boye 等[19]發(fā)現(xiàn)肝素硫酸鹽與載體衣殼的結(jié)合在此過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。

ILM 對(duì)非載體粒子的屏障作用主要與所帶電荷有關(guān)，對(duì)嚙齒類動(dòng)物來(lái)講，粒子大小的影響并不明顯[20]。帶負(fù)電荷的20 kDa 大小的葡聚糖可以順利通過(guò)ILM[21]，同樣大小的帶正電的粒子則被ILM 阻擋,即使2000 kDa 大小的帶負(fù)電粒子也比20 kDa 的帶正電粒子更有效地穿透至牛的視網(wǎng)膜中。

2 視網(wǎng)膜下注射

視網(wǎng)膜下注射是將藥物注射到感光細(xì)胞層和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層（retinal pigment epithelium，RPE）之間，注射后會(huì)造成150 μm 的間隙，可引起視網(wǎng)膜脫離和視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡。雖然該治療方式風(fēng)險(xiǎn)較大，但通過(guò)這個(gè)方式可直接將治療藥物送至靶組織視網(wǎng)膜，因此，視網(wǎng)膜下注射目前仍然是基因治療和干細(xì)胞治療的主要手段并有一些成功的報(bào)道[22-23]。

視網(wǎng)膜下注射給藥幾乎克服了眼后節(jié)給藥的所有屏障，該給藥途徑的屏障來(lái)自視網(wǎng)膜本身[24]。最近，Tao 等[25]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)核層和外核層是主要的擴(kuò)散屏障。除了細(xì)胞本身形成的物理屏障阻礙藥物擴(kuò)散外，視網(wǎng)膜內(nèi)某些細(xì)胞成分也可能與治療藥物產(chǎn)生相互作用，這些成分存在于感光細(xì)胞的基質(zhì)中以及RPE 細(xì)胞的表面，與治療藥物結(jié)合后阻斷藥物進(jìn)一步向靶細(xì)胞擴(kuò)散[21]。這可能是視網(wǎng)膜下注射后基因的表達(dá)往往局限于視網(wǎng)膜外層和RPE 層的原因[26]。

3 靜脈注射

靜脈注射是一種應(yīng)用廣泛的臨床給藥方式，比如靜脈滴注激素治療葡萄膜炎，靜脈滴注抗生素治療眼內(nèi)炎[27]等，經(jīng)靜脈注射后藥物在視網(wǎng)膜上的生物利用度小于5%[28]。因此，靜脈注射需要更高的濃度來(lái)達(dá)到相應(yīng)的治療效果，從而增加了副作用的可能性。血-視網(wǎng)膜屏障（blood retinal barrier，BRB）是藥物通過(guò)血運(yùn)途徑到達(dá)視網(wǎng)膜的主要障礙。

BRB 包括內(nèi)血-視網(wǎng)膜屏障（inner blood retinal barrier，i-BRB）和外血-視網(wǎng)膜屏障（outer blood retinal barrier，oBRB）兩部分，iBRB 由muller 細(xì)胞間的緊密連接組成，oBRB 由RPE細(xì)胞的緊密連接組成（圖2）。由于脈絡(luò)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮之間空隙較大，允許像蛋白質(zhì)這樣的大分子物質(zhì)通過(guò)，因此，脈絡(luò)膜血管層不是藥物眼內(nèi)擴(kuò)散的障礙。

圖1 玻璃體及內(nèi)界膜示意圖。內(nèi)界膜具有細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，形成間充質(zhì)細(xì)胞的基底膜。玻璃體凝膠是由不同類型膠原纖維網(wǎng)絡(luò)形成的，網(wǎng)絡(luò)間充滿透明質(zhì)酸。ILM：內(nèi) 界 膜；M：muller 細(xì)胞端足；G：ganglion 細(xì)胞

圖2 視網(wǎng)膜和血視網(wǎng)膜屏障（BRB）示意圖。NFL：神經(jīng)纖維層；GCL：神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；IPL：內(nèi)叢狀層；INL：內(nèi)核層；OPL：外叢狀層；ONL：外核層；PRS：光感受器段；RPE：視網(wǎng)膜色素上皮。1：神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；2：星形膠質(zhì)細(xì)胞；3：放射狀膠質(zhì)細(xì)胞；4：無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞；5：水平細(xì)胞；6：雙極細(xì)胞；7：感光細(xì)胞。iBRB 是由視網(wǎng)膜內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞與膠質(zhì)細(xì)胞間的緊密連接形成的。oBRB 由RPE 細(xì)胞之間的緊密連接構(gòu)成

脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜之間的大分子轉(zhuǎn)移主要受RPE 細(xì)胞間的緊密連接影響，連接復(fù)合體并不是靜態(tài)的結(jié)構(gòu)，而是處于打開(kāi)和關(guān)閉交替的動(dòng)態(tài)過(guò)程。除外被動(dòng)擴(kuò)散通過(guò)緊密連接，轉(zhuǎn)運(yùn)途徑還包括借助泵的主動(dòng)運(yùn)輸以及囊泡的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)[29]。有報(bào)道顯示，如果分子足夠小（＜0.4 nm）則可以自由通過(guò)緊密連接的孔隙擴(kuò)散，大于0.4 nm 的分子主要通過(guò)連接結(jié)構(gòu)的開(kāi)合來(lái)進(jìn)行擴(kuò)散[30]。一系列通過(guò)離體牛脈絡(luò)膜-RPE 復(fù)合體的研究顯示，從20 kDa 到80 kDa 不同大小熒光素標(biāo)記葡聚糖的通透性隨著分子量增大急劇下降[31]。除了大小、分子的親水性及所帶的電荷對(duì)通透性也有影響，Pitk?nen 等[31]測(cè)試了相同大小的β-阻滯劑的通透性,發(fā)現(xiàn)親脂性越強(qiáng),越能有效地穿過(guò)iBRB，親水性越強(qiáng)則越難通過(guò)屏障，oBRB 和i-BRB 這一趨勢(shì)十分相似[32]。總體來(lái)說(shuō)，小的親水性物質(zhì)主要通過(guò)細(xì)胞間的緊密連接進(jìn)行擴(kuò)散，而親脂性物質(zhì)主要通過(guò)跨細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑[31]。另一種屏障作用來(lái)自RPE 細(xì)胞和iBRB內(nèi)皮細(xì)胞上的P-糖蛋白，這種糖蛋白有著外流泵的作用，可以將藥物重新泵回血液，因此，今后的藥物研制要考慮如何避免被這種外流泵識(shí)別或者與協(xié)同應(yīng)用外流泵抑制劑[33]。對(duì)于以納米微粒為載體的藥物來(lái)講，納米粒的大小對(duì)藥物的通透性有明顯影響。Kim 等[34]給小鼠靜脈注射100 nm 和20 nm的金納米顆粒，僅在視網(wǎng)膜內(nèi)發(fā)現(xiàn)了20 nm 的納米粒。但有研究顯示經(jīng)抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體修飾后，由質(zhì)粒介導(dǎo)的85 nm 脂質(zhì)體可以順利通過(guò)BRB 進(jìn)入視網(wǎng)膜。

4 脈絡(luò)膜上腔注射

脈絡(luò)膜上腔（suprachoroidal space，SCS）注射是將藥物注射到脈絡(luò)膜和鞏膜之間，在注射的壓力下脈絡(luò)膜和鞏膜間會(huì)出現(xiàn)縫隙，體積會(huì)到達(dá)200 μl[35]。脈絡(luò)膜上腔注射和其他途徑一樣可以規(guī)避許多屏障，比眼前節(jié)注射和靜脈注射具有更高的生物利用度[36]。

SCS 注射根據(jù)靶組織不同藥物需要克服的屏障亦不相同，如果治療視網(wǎng)膜疾病，藥物需要通過(guò)脈絡(luò)膜和RPE 層，治療脈絡(luò)膜疾病，高脈絡(luò)膜環(huán)流則是藥物擴(kuò)散潛在的主要障礙[3,37-38]。

脈絡(luò)膜的屏障作用表現(xiàn)在兩個(gè)方面，一方面作為分子篩限制大分子藥物進(jìn)入，另一方面來(lái)自脈絡(luò)膜豐富的血流對(duì)藥物的清除作用。既往許多研究已經(jīng)觀察了脈絡(luò)膜對(duì)小分子、大分子以及顆粒的通透性，Tyagi 等[39]發(fā)現(xiàn)與眼周注射和玻璃體腔注射相比，通過(guò)脈絡(luò)膜上腔注射氟化鈉進(jìn)入視網(wǎng)膜的速度更快，濃度更高。物質(zhì)進(jìn)入眼后節(jié)的擴(kuò)散性依賴于分子量大小，將4 kDa 和40 kDa 熒光標(biāo)記葡聚糖注射到家兔SCS內(nèi)，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜和玻璃體內(nèi)4 kDa 的葡聚糖濃度明顯高于40 kDa[40]，本研究同時(shí)觀察了不同親脂力β 阻滯劑在視網(wǎng)膜和玻璃體的分布，發(fā)現(xiàn)親脂性越高分布越多，其機(jī)制可能是與結(jié)合位點(diǎn)的細(xì)胞膜及黑色素親脂化合物相互作用所致。對(duì)于納米顆粒和大分子來(lái)講，不僅理化性質(zhì)對(duì)其擴(kuò)散和分布有影響，注射部位也會(huì)影響其生物利用度，Chiang 等[41]發(fā)現(xiàn)在兔眼后睫狀動(dòng)脈一側(cè)注射的顆粒不能擴(kuò)散到另外一側(cè)。

與靜態(tài)屏障相比，脈絡(luò)膜血流循環(huán)形成的動(dòng)態(tài)屏障對(duì)藥物眼內(nèi)分布影響更大，目前已有許多相關(guān)研究報(bào)道[35]。Abarca等[42]采用豬眼體外實(shí)驗(yàn)觀察證實(shí)，經(jīng)SCS 注射高親水性藥物后，非灌注眼比灌注眼的藥物分布要高，但親脂性藥物差異不明顯。另有許多研究也發(fā)現(xiàn)熒光素標(biāo)記的不同分子量葡聚糖、貝伐單抗及氟化鈉注射后通常在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)很快被清除[35,39,43]，而20 nm～10 um 的非降解顆粒注射后2 個(gè)月還可以在脈絡(luò)膜上腔檢測(cè)到[43]，上述研究提示納米及大分子給藥系統(tǒng)持續(xù)釋放可以避免被快速清除，因此具有很大的研究潛力和應(yīng)用前景。

5 眼周注射

眼周注射用于臨床已經(jīng)很久，包括結(jié)膜下注射、球旁注射、球后注射等，侵入性較玻璃體腔注射小，但傳統(tǒng)認(rèn)為通過(guò)該途徑藥物到達(dá)視網(wǎng)膜的濃度很低[44]，不但需要克服鞏膜、脈絡(luò)膜、RPE 層等靜態(tài)屏障，還要克服脈絡(luò)膜血流和鞏膜血流等動(dòng)態(tài)屏障及這些屏障之間相互作用，屏障功能還和藥物的性質(zhì)相關(guān)[45]。下面主要討論鞏膜的屏障作用，其他屏障已在前面部分?jǐn)⑹觥?/p>

鞏膜的致密結(jié)構(gòu)形成了藥物擴(kuò)散至眼內(nèi)的物理屏障，藥物能否通過(guò)鞏膜纖維網(wǎng)狀組織很大程度取決于其分子量的大小，分子量越大越難通過(guò)，同時(shí)大分子物質(zhì)的清除率也比小分子低得多[45]。藥物所帶的電荷對(duì)其通透性也有一定影響,在生理環(huán)境下帶負(fù)電荷[46]。如果大分子物質(zhì)帶有較多負(fù)電荷，則可能由于電荷排斥作用而抑制通透性。僅次于分子量大小和電荷的影響因素是親脂性，親脂性物質(zhì)比親水性物質(zhì)更不容易透過(guò)鞏膜，這可能是由于鞏膜水化蛋白多糖的特性決定的[47]。而對(duì)于親水性藥物來(lái)說(shuō)其脈絡(luò)膜生物利用度通常很低，因?yàn)榇蟛糠炙幬飼?huì)在脈絡(luò)膜的血流中被清除[46]。眼周注射后藥物能否成功到達(dá)視網(wǎng)膜取決于多種因素之間的平衡，較小的微粒容易穿透各層屏障到達(dá)視網(wǎng)膜，但注射后會(huì)被迅速清除，大顆粒物質(zhì)注射后可以較長(zhǎng)時(shí)間存留，但不容易穿透各層屏障[3,48-49]，因此，目前藥物轉(zhuǎn)運(yùn)方法傾向于采用緩釋系統(tǒng)將納米或微粒物質(zhì)釋放至眼內(nèi)[3,49]。另外，不同物種間鞏膜厚度相差很大，這對(duì)鞏膜的通透性有直接影響，Nicoli 等[50]發(fā)現(xiàn)豬鞏膜的厚度是人鞏膜厚度的2 倍，人比豬的鞏膜通透性要高3 倍，相反，兔子的鞏膜厚度只有人的一半，這一點(diǎn)在研究中應(yīng)予以考慮。

6 經(jīng)結(jié)膜給藥

采用滴眼液給藥是最方便、安全的眼部給藥方式，但由于淚液的稀釋、角膜、結(jié)膜等眼表的屏障作用、晶體、玻璃體的阻擋作用以及血眼屏障的存在，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為滴眼劑在眼前部組織中濃度高，但是很難在眼后節(jié)尤其是視網(wǎng)膜達(dá)到有效的治療濃度。從理論上來(lái)講，滴眼劑藥物到達(dá)視網(wǎng)膜的途徑有兩個(gè)：一個(gè)是通過(guò)角膜途徑，另外一個(gè)是結(jié)膜途徑。結(jié)膜上皮較角膜具有更高的可滲透性，同時(shí)其表面積數(shù)倍于角膜，即使是親水性藥物和大分子藥物同樣可較好地滲透結(jié)膜[51-52],目前該途徑得到越來(lái)越多的關(guān)注。OZAKI 等[53]發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶抑制肽滴眼液可以通過(guò)該途徑到達(dá)視網(wǎng)膜和視神經(jīng)組織，這一結(jié)果提示采用滴眼劑給藥方式治療眼后節(jié)疾病的可能。

圖3 各給藥途徑總覽

最近有研究眼部滴眼液治療視網(wǎng)膜疾病的報(bào)道。Yamaguchi M 等[54]發(fā)現(xiàn)0.8% ripasudil 滴眼液可以明顯改善視網(wǎng)膜血流灌注；Vigneswara V 等[55]將相同濃度的色素上皮衍生因子按每天滴眼和每周玻璃體注射進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)滴眼劑組比玻璃體注射組具有更好的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞保護(hù)作用。因此，雖然是最傳統(tǒng)的給藥方式，滴眼液在眼底病治療方面仍有非常好的前景。

7 小結(jié)

綜上所述，不同給藥途徑對(duì)藥物到達(dá)眼后節(jié)形成不同的生理及物理屏障（圖3），除化學(xué)藥物及生物制劑外，中藥制劑亦是亟待開(kāi)發(fā)的寶庫(kù),但中藥在眼內(nèi)的有效濃度、在各屏障的通透特點(diǎn)以及如何提高通透率目前所知甚少。因此，加強(qiáng)眼內(nèi)屏障的研究，尋找更有效的給藥方法和給藥途徑，尤其是加強(qiáng)中藥眼用制劑的研究將是我們下一步的努力方向。