閩西地區豬流行性腹瀉病毒N基因分子進化及序列分析

董波 李靜楠 曹雪珍

摘要：分析閩西地區豬流行性腹瀉病毒（PEDV）N基因的遺傳進化特征，收集閩西地區豬流性腹瀉病例組織樣品8份，用逆轉錄PCR（RT-PCR）擴增N基因，連接至pMD-18T載體進行測序，并與國內外已知參考毒株序列進行比對及遺傳進化分析。結果顯示，8株閩西流行毒株之間N基因核苷酸的同源性為9.8%～100.0%，推導的氨基酸序列的同源性為99.5%～100.0%，而閩西毒株與早期疫苗毒株CV777和SM98的同源性較遠。氨基酸序列分析表明，閩西毒株氨基酸序列存在15處突變，與2010年后中國流行毒株變異位點相同。提示閩西地區毒株為目前國內流行毒株，與疫苗毒株親緣關系較遠，可能導致機體針對疫苗毒株產生的抗體不能夠有效抵抗變異毒株，不能給豬群提供很好的免疫保護，因此需要基于變異毒株研究出有針對性的疫苗來預防PEDV。

關鍵詞：豬流行性腹瀉病毒;N基因;遺傳分析

中圖分類號： S852.65+1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）17-0059-04

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，簡稱PED）是由豬流行性腹瀉病毒引起的一種高度接觸性傳染病，以腹瀉、嘔吐為主要臨床特征，冬、春季多發[1]。該病在世界大多數國家均有報道，尤其對韓國、中國、日本、菲律賓、泰國等亞洲國家造成了嚴重經濟損失，引起養豬業的廣泛關注[2]。2010年末，我國暴發的PED影響了河北、安徽、廣西、廣東、浙江、江西、四川、湖南、福建等省份的養豬業[3]。此次疫情造成的損失慘重，甚至之前接種過豬流行性腹瀉病毒（PEDV）疫苗的豬群也同樣發病，究其原因，可能是由于流行毒株變異或者毒力增強，使現有疫苗難以提供免疫保護[4]。

豬流行性腹瀉病毒為冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，為單股正鏈RNA病毒，編碼2個復制酶多聚蛋白ppla和pplab，1個非結構蛋白ORF3和4個結構蛋白纖突蛋白（spike，簡稱S）、膜蛋白（membrane，簡稱M）、核衣殼蛋白（nucleocapsid，簡稱N）和小膜蛋白（small membrane，簡稱E）[5]。其中，N蛋白由1 326個核苷酸組成，編碼442個氨基酸。N蛋白是一種多功能磷酸化蛋白質，能夠與細胞膜和磷脂結合，改變宿主細胞的轉錄，促使RNA復制體的形成和病毒組裝[6]。N基因在誘導免疫和病毒感染的致病機制中起重要作用，N蛋白的表達可抑制細胞RNA和蛋白質G2/M期的合成從而促進病毒的繁殖[7]。在早期感染PEDV時，宿主體內就能產生抗N蛋白高水平的抗體，因此N蛋白可作為早期檢測發病豬是否感染PEDV的免疫靶細胞[8]。

近年來，PEDV的流行趨勢不斷增長，給養豬業造成嚴重的影響。因此，對PEDV的遺傳變異情況進行監測是防控的重要環節。本研究收集閩西地區PEDV流行毒株，利用逆轉錄PCR（RT-PCR）擴增N基因，將PEDV N基因序列進行同源性比較，繪制系統發育進化樹，理清閩西地區PEDV與國內外流行毒株以及疫苗毒株之間的遺傳進化關系，為做好PEDV的防控提供資料參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品選取2013年1月至2016年12月閩西地區規模化養豬場的PEDV陽性樣品8份。1.2 主要試劑

AxyPrep總RNA小量制備試劑盒、AxyPrep質粒DNA小量試劑盒、AxyPrep凝膠回收試劑盒，購自康寧生命科學（吳江）有限公司;dNTP、反轉錄酶M-MLV、5×M-MLV buffer、pMD18-T Vector，購自寶生物工程（大連）有限公司;DL2000 DNA marker、10×loading buffer，購自廣州瑞真生物技術有限公司;Oligo（dT）18、Murine RNase Inhibitor、T4 DNA Ligase、10×Ligase Buffer，購自南京諾唯贊生物科技有限公司;胰蛋白酶（tryptone）、酵母（yeast extract），購自OXOID公司;Ampicillin（氨芐西林）（100mg/mL）、NaCl、瓊脂粉，購自Biowest公司;異丙醇、三羥基甲基氨基甲烷（Tris堿）、溴化乙錠（EB）、三氯甲烷、乙二胺四乙酸（EDTA）、乙醇、十二烷基硫酸鈉（SDS）、DEPC（焦碳酸二乙酯）水，購自廣東省汕頭市西隴化工股份有限公司。

1.3 提取病毒總RNA及逆轉錄

按照試劑盒提供的操作手冊，從試驗豬小腸組織及內容物中提取總RNA。取潔凈EP管，加入RNA 11 μL、Oligo（dT）18 1 μL，12 000 r/min離心40 s，于70 ℃水浴10 min，加入 5×M-MLV Buffer 5 μL、M-MLV 1 μL、dNTP 1 μL、DEPC水6 μL，混勻后，42 ℃水浴30 min，95 ℃ 水浴10 min。cDNA于 -80 ℃ 下保存。

1.4 E基因的擴增

參考GenBank上已發表的PEDV毒株N基因序列，使用Premier Premier 5.0生物軟件設計合成1對特異性引物，PEDV-N-F：GGATCCATGGCTTCTGTCAGCTTTC;PEDV-N-R：CTCGAGTTTCAACGGCCGTATCACC。以cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應程序如下：95 ℃預變性5 min;94 ℃ 變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環;72 ℃延伸10 min。使用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，觀察并記錄結果。

1.5 重組質粒的構建和鑒定

采用AxyPrep凝膠回收試劑盒回收PCR產物，將純化產物與pMD18-T Vector連接，16 ℃水浴4 h。將10 μL連接產物轉化入DH5α感受態細胞，37 ℃培養過夜。提取質粒，進行鑒定。將陽性質粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.6 序列分析

8株閩西毒株分別命名為LY201301、LY201302、LY201401、LY201402、LY201501、LY201502、LY201601和LY201602。采用表1中標準毒株的基因庫登錄號，獲取參考毒株N基因序列。通過DNAstar和MEGA 5.2分子生物學分析軟件對8株閩西地區的PEDV N基因序列與國內外已發表的毒株進行同源性分析，繪制PEDV基因系統遺傳進化樹。

2 結果與分析

2.1 N基因的擴增、純化、克隆及測序

采用RT-PCR技術，對8份樣品的N基因進行擴增，產物經凝膠電泳鑒定，由圖1可知，獲得大小約為1 326 bp的基因片段。將純化后的PCR產物連接到pMD18-T載體上，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，序列結果正確。

2.2 N基因的序列比對及同源性分析

閩西毒株N基因核苷酸序列之間的同源性為99.8%～100.0%，與26株引用毒株之間的同源性為94.3%～99.8%。閩西毒株與2010年以后中國分離毒株的同源性均在99%以上，與2013年美國毒株的同源性也均在99%以上。由圖2可知，經遺傳進化分析，34株毒株可分成3大組，Ⅰ組包括疫苗株CV777、2株韓國毒株（Attenuated DR13和SM98）及6株早期中國毒株;Ⅲ組包括2013年分離的4株美國毒株、1株韓國毒株、2010年后分離的中國流行毒株以及8株閩西毒株。系統發育分析顯示，閩西毒株與經典毒株CV777、2010年前中國分離毒株以及韓國毒株（Attenuated DR13和SM98）的親緣性較遠，與2010年以后中國分離毒株的親緣性較高，與2013年美國毒株的親緣性也較高，說明閩西毒株與目前國內以及美國流行毒株可能來自同一祖先。

2.3 N基因的氨基酸結構特征

由表2的序列比對結果可知，N基因全長為1 326 bp，編碼442個氨基酸，包含1個完整的閱讀框架。閩西毒株與疫苗毒株CV777相比，氨基酸序列僅存在15處突變。這些突變位置與2010年后的中國變異毒株一致。

3 討論

在PEDV的RNA合成過程中，N蛋白能與細胞膜磷脂結合，促進病毒的組裝和RNA復制體的形成[9]。另外，在PEDV的結構蛋白中，N蛋白所占比例最大，它能在感染的細胞中大量表達，并且在感染初期，動物體內就能產生較高水平的抗N蛋白的抗體[10]。N蛋白具有高度保守的特性，可以作為早期診斷的靶蛋白，可利用N蛋白建立PEDV的分子生物學診斷技術[11]。因此，選擇N基因進行PEDV遺傳進化分析，有助于了解病毒的流行趨勢與進化規律，對于病毒的防控和疫苗的研制具有重要意義[12]。本研究收集8株閩西毒株，利用PCR擴增獲得8株病毒N基因，使用生物信息學軟件進行系統發育分析，有助于從分子水平闡明閩西PEDV毒株與國內外毒株的親緣關系。

同源性分析結果顯示，閩西毒株之間的核苷酸同源性為 99.8%～100.0%，與2010年后中國分離毒株的進化關系較近，說明閩西毒株與目前國內流行毒株具有很高的同源性。然而，閩西PEDV流行毒株與疫苗毒株CV777的核苷酸同源性為94.0%～95.4%，遺傳進化關系較遠，提示以CV777為免疫原設計的疫苗，在防治PED方面可能作用不顯著，成為控制PEDV暴發的主要隱患。另外，閩西毒株與2013年美國流行毒株的同源性較高，親緣性較近，均屬于Ⅲ組，說明閩西流行毒株與2010年后中國分離毒株以及2013年后美國分離毒株可能來自同一祖先。并且由遺傳進化樹可見，早期韓國毒株（virulent DR13）也處于Ⅲ組，提示該毒株和目前國內外流行毒株存在著潛在關系，需要進一步分析。8株閩西毒株N基因無特有的片段缺失和插入，存在15處相同突變，這些突變位點與2010年后中國分離毒株的突變位點一致，進一步證實了閩西毒株屬于2010年后中國流行毒株，也表明N基因相對保守，在目前國內的流行毒株中基本沒有出現變異。

總之，本研究結果證實閩西PEDV毒株屬于目前國內外的流行毒株，與疫苗毒株（CV777）的進化關系較遠，可能導致由CV777設計的疫苗對當前流行毒株的保護力不夠，不能給豬群提供很好的免疫保護，因此需要設計有針對性的疫苗來預防PEDV。并且氨基酸序列分析表明，閩西毒株N基因與疫苗毒株CV777相比存在15處基因改變，但是與目前流行毒株相比沒有明顯變化，證明N基因是高度保守的，因而可以作為疫苗候選基因。本研究結果希望能從分子水平闡明閩西地區PEDV的遺傳進化特征，同時希望為PEDV疫苗的設計提供資料基礎。參考文獻：

[1]殷 震，劉景華. 動物病毒學[M]. 北京：科學出版社，1985.

[2]Chen J，Wang C H，Qiu H，et al. Molecular epidemiology of porcine epidemic diarrhea virus in China[J]. Archives of Virology，2010，155（9）：1471-1476.

[3]Pan Y F，Tian X Y，Li W，et al. Isolation and characterization of a variant porcine epidemic diarrhea virus in China[J]. Virology Journal，2012，9（1）：1-9.

[4]Stevenson G W，Hoang H，Schwartz K J，et al. Emergence of porcine epidemic diarrhea virus in the United States：clinical signs，lesions，and viral genomic sequences[J]. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2013，25（5）：649.

[5]呂茂杰，陳建飛，時洪艷，等. 豬流行性腹瀉病毒核衣殼蛋白與感染細胞核磷蛋白的共定位分析[J]. 微生物學報，2011，61（5）：643-647.

[6]Li B X，Ge J W，Li Y J. Porcine aminopeptidase N is a functional receptor for the PEDV coronavirus[J]. Virology，2007，365（1）：166-172.

[7]Lee H-K，Yeo S-G. Cloning and sequence analysis of the nucleocapsid gene of porcine epidemic diarrhea virus Chinju99[J]. Virus Genes，2003，26（2）：207-212.

[8]孫東波，馮 力，時洪艷，等. 豬流行性腹瀉病毒分子生物學研究進展[J]. 動物醫學進展，2006，27（10）：11-14.

[9]李好磊，李葉珍，趙 顧，等. 豬流行性腹瀉病毒N基因重組真核質粒構建及其表達[J]. 浙江農業學報，2017，29（7）：1103-1109.

[10]吳玉璐，朱建平，楊 莘，等. 豬流行性腹瀉病毒N基因的表達及抗原性分析[J]. 中國預防獸醫學報，2013，35（4）：299-303.

[11]易新健，劉 準，張翠翠，等. 一株豬流行性腹瀉病毒S、M、N基因的遺傳變異分析[J]. 動物醫學進展，2017，38（2）：12-16.

[12]祁光宇，劉 斌，趙興緒，等. 豬流行性腹瀉病毒HB2015分離株N基因表達及單克隆抗體的制備[J]. 江蘇農業學報，2018，34（1）：76-80.