乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜解毒酶活性的影響

劉暢 王芳 陳曉婷

摘要：乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜具有觸殺作用，但其作用機制尚未明確。采用有機溶劑超聲提取乳漿大戟毒素，并利用生物化學方法測定枸杞棉蚜取食后體內相關解毒酶的活性變化。結果表明，隨乳漿大戟毒素濃度升高，羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉移酶活性降低，表明乳漿大戟毒素對這2種解毒酶具有抑制作用;堿性磷酸酶活性和P450酶含量顯著升高，說明乳漿大戟毒素對這2種解毒酶具有誘導作用。乳漿大戟毒素可顯著影響昆蟲的代謝酶，且其對羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉移酶的抑制作用可能與其毒殺作用有關。為闡明乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜致死的作用機制，開發以乳漿大戟為基礎的枸杞蚜蟲可持續控制新技術提供理論依據。

關鍵詞：乳漿大戟;毒素提取;枸杞棉蚜;體內解毒酶;活性變化;綠色防控

中圖分類號： S482.3+9;S435.671 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）17-0125-03

蚜蟲是危害枸杞的重要害蟲[1-2]，廣泛分布于我國枸杞種植區[3]。其中，枸杞蚜蟲在寧夏回族自治區地區1年發生15代，繁殖系數高，世代重疊嚴重，對枸杞子的產量和品質影響極大[4]。蚜蟲聚集于枸杞新梢或莖部，吸食汁液，影響枸杞正常開花結果。目前，枸杞蚜蟲的防治仍以化學防治為主，但是長期大量不合理使用化學農藥，導致枸杞蚜蟲抗藥性日趨嚴重，加大了枸杞蚜蟲的猖獗危害[5]。同時，化學農藥帶來的農藥殘留超標、減少天敵數量及環境污染等一系列問題也日益突出。這些不利因素促使人們迫切尋求環境友好的植物保護方式。近年來，在農業生產實踐中植物源農藥主要來自于植物中具有活性的天然物質，比如噻吩類及多炔類化合物等[6]，這些殺蟲劑的開發源于其新穎的靶標及專一性強、安全性高、不易產生抗藥性等特點[7-8]。因此研究具有殺蟲活性的天然化合物致毒機制，探索新作用靶標，是農藥開發研究范疇的重點和前沿。

乳漿大戟（Euphorbia esula Linn.）為大戟科，多年生草本植物，常見于干旱山坡、草地或路邊，在寧夏主要分布于六盤山、羅山、賀蘭山及固原市等草地，資源豐富。乳漿大戟根系發達，生命力極強，不僅占據草場面積，消耗草地的水分和養分，競爭取代其他有經濟價值的優良牧草，使草場的產量和質量下降，而且植物本身有毒[9]，大面積草場因乳漿大戟的蔓延被牲畜忌避而荒廢，給草地畜牧業生產造成很大的經濟損失[10]。乳漿大戟含有的白色或黃白色乳汁，對皮膚有刺激性和毒性，但可以抗腫瘤、抗菌和抗白血病等，具有重要的藥用價值[11]。2013年王芳等發現其對枸杞蚜蟲具有一定的殺蟲活性[12]，隨后研制了乳漿大戟制劑，并明確了其作用方式，但對枸杞蚜蟲的致死機制并不明確[13]。為更好地建立以乳漿大戟為基礎的枸杞蚜蟲綠色防控新技術，明確其對枸杞蚜蟲的致死作用機制尤為重要。通過測定乳漿大戟提取物對枸杞蚜蟲體內解毒酶活性的變化，從毒理學揭示乳漿大戟對枸杞蚜蟲致死的作用機制，為進一步深入了解其致死作用機制及建立枸杞蚜蟲綠色防控新技術提供技術支撐，為化學農藥的減施、枸杞害蟲的可持續治理及枸杞安全生產提供有力保障。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試蟲源 枸杞棉蚜（Aphis gossypii Glover）采自園林場枸杞園，均為個體大小一致、健康的無翅成蚜。采集時間為2017年8月。

1.1.2 供試試劑 毒扁豆堿購自Sigma公司;α-乙酸萘酯、固藍B鹽、十二烷基硫酸鈉（SDS）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）等均為國產生化試劑;谷胱甘肽-S-轉移酶測定試劑盒、酸性磷酸酶（ACP）測試盒、堿性磷酸酶（AKP）測試盒、昆蟲（Insect）細胞色素P450（CYP450）ELISA檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜成蟲羧酸酯酶活性影響 將乳漿大戟干粉樣品用乙醇超聲波提取3次，合并提取液，旋轉蒸發儀濃縮至干，得乳漿大戟毒素。參照Asperen的方法[14]，將枸杞棉蚜（每個處理500頭以上）用乳漿大戟毒素25、50、100、200 mg/mL不同濃度藥液處理，12 h后挑選活蟲200頭，加0.04 mol/L，pH值7.0的磷酸緩沖液5 mL，冰浴勻漿，勻漿液于轉速10 000 r/min下，4 ℃離心15 min，把上清液作為酶源。以α-乙酸萘酯（3×10-4 mol/L，含10-4 mol/L毒扁豆堿）為底物，經酯酶水解后生成α-萘酚與顯色劑（5%十二烷基硫酸鈉水溶液中含1%堅牢藍B）作用變為深藍色，測定波長600 nm處的吸光度，重復3次，以酶量（mL）為自變量，吸光度為因變量，繪制標準曲線，計算1 mL酶液生成的α-萘酚量，酶液再經考馬斯亮藍法測定蛋白質含量（μg/頭），代入標準曲線中算出羧酸酯酶的比活力[μmol/（mg·15 min）]。

1.2.2 乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜成蟲谷胱甘肽S-轉移酶影響 乳漿大戟毒素提取方法見“1.2.1”節，酶源處理參照“121”節。采用谷胱甘肽S-轉移酶測定試劑盒測定谷胱甘肽S-轉移酶活性。其原理為

谷胱甘肽+1-氯-2，4-二硝基苯GST谷胱甘肽二硝基苯復合 物+ 鹽酸;

GSH+C6H3（NO2）2ClGSTC6H3（NO2）2GS+HCl。

還原型谷胱甘肽（GSH）在谷胱甘肽S-轉移酶催化下與1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB底物）反應，在反應時間內，谷胱甘肽S-轉移酶活性與反應前后底物濃度呈正方向線性關系。谷胱甘肽S-轉移酶活性越強，谷胱甘肽含量減少越多。

1.2.3 乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜成蟲磷酸酶活性影響 乳漿大戟毒素提取方法見“1.2.1”節，酶源處理參照“1.2.1”節。采用南京建成生物工程研究所的酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）測定試劑盒測定磷酸酶活性。其原理為磷酸苯二鈉在酸性和堿性磷酸酶催化作用下產生游離酚和磷酸，酚與4-氨基安替吡啉在堿性溶液中經鐵氰化鉀氧化變成紅色，根據顏色深淺程度測定酶活性大小。

1.2.4 乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜成蟲細胞色素P450酶含量影響 乳漿大戟毒素提取方法見“1.2.1”節，酶源處理參照“121”節。采用細胞色素P450試劑盒測定昆蟲細胞色素P450酶含量。試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗。往酶標板的微孔中，依次加入標本、標準品、辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體，經過溫育洗滌。3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（TMB）在過氧化物酶的催化下變藍色，并在酸的作用下變成黃色。顏色的深淺程度和樣品的細胞色素P450酶活性呈正相關關系。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度，計算樣品P450酶含量。

2 結果與分析

2.1 乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜羧酸酯酶活性的影響

由圖1可見，乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜成蟲羧酸酯酶活性有一定的抑制作用，當乳漿大戟濃度為50 mg/mL時，抑制作用達到20%，當乳漿大戟毒素濃度達到 200 mg/mL 時，抑制作用達到40%。

2.2 乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜成蟲谷胱甘肽S-轉移酶活性的影響

由圖2可見，乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜成蟲谷胱甘肽 S- 轉移酶活性有顯著的抑制作用（P<0.05），隨著毒素濃度增加，抑制作用增強，與對照相比，當乳漿大戟毒素濃度達到200 mg/mL時，抑制作用達到90%。

2.3 乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜成蟲酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性影響

用微板法測定乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜成蟲ACP和AKP活性的影響，結果見圖3。乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜成蟲ACP活性沒有顯著性影響。AKP具有誘導作用，當乳漿大戟毒素濃度增加時，AKP活性升高，當乳漿大戟毒素濃度達到50 mg/mL時，與對照相比AKP活性顯著升高（P<0.05）。

2.4 乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜成蟲細胞色素P450酶含量影響

采用雙抗體-步夾心法酶聯免疫吸附法測定乳漿大戟毒素對細胞色素P450酶含量的影響，結果見圖4。乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜成蟲細胞色素P450酶含量有顯著的誘導作用。隨著濃度增加，P450酶含量顯著升高，當乳漿大戟毒素濃度達到200 mg/mL時，P450酶含量變化與乳漿大戟毒素濃度 100 mg/mL 時相比不顯著。

3 結論與討論

一直以來， 科研人員致力于開發具有生物活性的植物源農藥，對植物源農藥的應用，采用簡單方法就是用粗提物進行加工利用，以達到防治害蟲的目的。乳漿大戟作為植物源農藥原材料來防治枸杞棉蚜，具有很大的發展潛力。筆者實驗室前期研究發現，乳漿大戟對枸杞棉蚜具有顯著的毒殺作用，并且以觸殺作用為主。枸杞棉蚜在取食有毒有害植物時，體內的酶也會發生變化，接觸植物毒性嚴重影響棉蚜體內的酶活性變化。棉蚜對有毒物質刺激反應的劇烈程度可能與化合物的毒性大小有關。本研究從解毒代謝方面揭示了乳漿大戟對枸杞棉蚜的致死作用機制。隨著乳漿大戟毒素濃度升高，羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉移酶活性降低，說明乳漿大戟毒素對這2種解毒酶具有抑制作用;堿性磷酸酶活性和P450酶含量顯著升高，說明乳漿大戟毒素對這2種解毒酶具有誘導作用。

羧酸酯酶、谷胱甘肽S-轉移酶、酸性/堿性磷酸酶和細胞色素P450酶系[15]是昆蟲體內重要的解毒代謝酶，參與水解、還原、氧化、軛合等代謝過程[16-18]。本研究發現，枸杞棉蚜取食后，成蟲體內羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉移酶活性受到顯著抑制，導致其乳漿大戟有毒物質的解毒代謝能力下降，引起昆蟲死亡。羧酸酯酶可以與進入昆蟲體內的有毒物質迅速結合，將有毒物質在到達靶標作用位點前阻隔或降解。當枸杞棉蚜取食乳漿大戟毒素后，羧酸酯酶活性降低，降解毒素能力下降，因此毒素迅速到達靶標作用位點而發揮作用。谷胱甘肽S-轉移酶是昆蟲對農藥或者有毒物質代謝中重要的共軛酶系之一，它能使外源的親電基團與體內的還原型谷胱甘肽發生共軛代謝，而保護體內其他親核的中心[19-20]，乳漿大戟毒素對谷胱甘肽S-轉移酶活性的抑制，可能會使谷胱甘肽S-轉移酶對內源或外源毒素的降解能力下降。乳漿大戟毒素處理枸杞棉蚜后堿性磷酸酯酶和細胞色素P450酶被誘導激活，可能是昆蟲的一種應激性反應，即增強昆蟲對毒素解毒代謝，以起到解毒作用[21]。這種激活作用與昆蟲對植物的抗性有關，可能是由于乳漿大戟毒素影響了昆蟲體內的水解代謝，或外源物乳漿大戟毒素刺激枸杞棉蚜增強了水解代謝，提高了昆蟲本身的耐藥性。如果開發為植物源藥劑，可通過與代謝酶抑制劑進行復配來提高乳漿大戟毒素的藥效。

綜上所述，乳漿大戟毒素對枸杞棉蚜羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉移酶的抑制與其毒殺作用有關，隨著毒素濃度升高，其毒殺作用增強，昆蟲的解毒代謝能力變弱，最終死亡。羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉移酶是昆蟲體內重要的解毒代謝酶，其可能是乳漿大戟的作用靶標之一，由于乳漿大戟的致毒機制復雜多樣，至今作用靶標還不明確，因此有必要對其進一步從微觀層面深入研究，將有望開發出作用機制獨特的植物源農藥。

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