牛傳染性鼻氣管炎病毒部分gB蛋白的原核表達及抗原性分析

何小麗 李凡飛 王文佳

摘要：為對牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）gB基因進行原核表達，并對表達產物進行抗原性分析，利用筆者所在實驗室已構建好的gB-BL21重組陽性菌落，進行異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導表達，并對培養及誘導表達條件（IPTG最佳濃度、作用時間）等影響表達的因素進行優化，然后將表達的gB重組蛋白進行親和層析純化。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結果表明，gB蛋白在大腸桿菌中高效表達，表達蛋白的相對分子量約為32.4 ku，與預期的蛋白大小一致。經BCA（聚氰基丙烯酸正丁酯）蛋白含量測定試劑盒測定，gB重組蛋白濃度為 1.84 mg/mL。Western Blot結果顯示，純化后的gB重組蛋白能被標準IBR陽性血清識別，說明表達的目的蛋白具有良好的反應原性，可作為IBRV檢測的特異性抗原。試驗為建立牛傳染性鼻氣管炎診斷方法及研究gB蛋白的功能特性提供了材料和技術理論支持。

關鍵詞：牛傳染性鼻氣管炎;gB蛋白;原核表達;純化;抗原性分析

中圖分類號：S852.4+3 ? 文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）17-0189-04

牛傳染性鼻氣管炎（infectious bovine rhinotracheitis，簡稱IBR）是由牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，簡稱IBRV）[又稱為牛皰疹病毒1型（BHV-1）]感染所引起的高度接觸性傳染病。該病具有廣泛的嗜組織性，在臨床上表現為呼吸道型、生殖道感染型、腦膜腦炎型和流產型4種類型。該病呈世界性廣泛分布，世界動物衛生組織將其列為二類動物傳染病，每年都給全球的養牛業帶來了不可估量的經濟損失[1]。BHV-1基因組中已被編碼為蛋白的共有73個開放閱讀框[2]。BHV-1編碼的結構蛋白有33種，其中13種蛋白與核衣殼有關，10種編碼糖蛋白[3]。gB是在病毒吸附、進入細胞及胞間擴散和融合中起著重要作用的主要膜蛋白，也是主要的抗原蛋白，是BHV-1中最保守的蛋白[4]。

我國于1980年從國外進口的奶牛中檢測到了引起該病的病毒，自此許多學者開始對該病的流行病學進行調查，結果表明我國國內大部分省份已存在較為廣泛的牛傳染性鼻氣管炎病毒的感染且呈現逐年上升的現象。目前，并沒有特效的藥物治療此病，我國主要采取以預防為主的措施防控此病。本試驗通過對IBRV gB蛋白的誘導表達，旨在獲得IBR高效表達蛋白，為IBR的檢測方法提供原材料和技術支持。

1 材料與方法

1.1 血清與菌株

IBR標準陽性血清，購自美國IDEEX公司;牛傳染性鼻氣管炎gB-BL21陽性重組菌株，由筆者所在實驗室前期構建保存。

1.2 主要試劑盒

His標簽蛋白純化試劑盒，購自北京康為世紀生物科技有限公司;AEC底物顯色試劑盒，購自索萊寶公司;AEC蛋白純化試劑盒，購自凱基生物公司。

1.3 主要試劑

主要試劑如下：瓊脂糖，購自西班牙;異丙基硫代-α-D半乳糖苷（IPTG），Thermo Fisher;氨芐青霉素（AMP），Amresco;瓊脂粉，OXOID;蛋白彩虹marker，Thermo Fisher;十二烷基硫酸鈉（SDS）上樣緩沖液（2×），SDS購自西安國安生物科技有限公司;考馬斯亮藍G-250，Thermo Fisher;過硫酸銨，Biotopped;10%SDS;四甲基乙二胺（TEMED），Biotopped;1 mol/L pH值為6.8的Tris-HCl，Tris購自Biotopped;1.5 mol/L pH值為8.8的Tris-HCl;29 ∶ 1的丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺蛋白電泳緩沖液（5×），Biotopped;聚偏氟乙烯（PVDF）膜，Thermo Fisher;濾紙， 沈陽市長城過濾紙板有限公司;甘氨酸，西安國安生物科技有限公司;脫脂奶粉，完達山乳業;Tween20，Biotopped;磷酸緩沖鹽溶液（PBS）;無水乙醇，天津市福晨化學試劑廠;0.22 μm濾膜，Sigma;Rabbit Anti-Bov IgG/HRP[辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG]，Sigma。其他化學試劑均購自天津市化學大茂化學試劑廠。此外，聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）蛋白純化試劑盒，購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 重組蛋白gB的誘導表達及條件優化 取1 μL連接好的重組質粒PET32a-gB，涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養基上，于37 ℃培養12～15 h。然后用無菌接種棒挑取單個重組菌落，接種于5 mL液體培養基中，37 ℃ 搖床上于 220 r/min 培養12～15 h。取培養的菌液按1 ∶ 50的比例接種于新鮮的LB（AMP+）液體培養基中，繼續培養 2～3 h，直至D600 nm達到0.6～0.8，取1.0 mL菌液保存，作為IPTG誘導前樣品，將剩余的菌液分成6管，分別向其中加入不同濃度的IPTG，使其終濃度依次為0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、2.0 mmol/L，然后置于37 ℃搖床上培養，分別于1、2、3、4、5 h后從5管中各取1 mL誘導菌液，室溫下于8 000 r/min離心 2 min，去上清，采用PBS重懸沉淀，重復離心，最后棄盡上清，用PBS重懸沉淀，混勻，然后向其中加入2×SDS上樣緩沖液，置于沸水中煮沸5 min，取出后迅速放入冰浴中，適當時間后，放入-20 ℃冰箱中保存備用。

1.4.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）的檢測 按照說明配制分離膠與濃縮膠，在分離膠上面插入梳子，靜置約30 min，使凝膠完全聚合。然后將玻璃制膠板放入電泳槽中，在電泳槽中加入適量的電泳液，緩慢垂直拔出梳子，用移液器沖洗加樣孔。向第1個加樣孔中加入蛋白彩虹marker，在相鄰的泳道中依次加入樣品。接通電源，起始電壓為80 V，當染料進入分離膠后，提高電壓至120 V，電泳1 h。待溴酚藍到達電泳槽的底部時，關閉電源，小心地從玻璃板上剝下凝膠，切掉濃縮膠，并對分離膠進行標記，然后將其放入考馬斯亮藍染色液中，染色1 h。結束后，取出分離膠，將其轉入脫色液中脫色，觀察結果。

1.4.3 重組蛋白的可溶性分析 參照“1.4.1”節的方法，分別利用蛋白的最優表達條件對重組蛋白進行誘導表達，離心，棄上清，在沉淀中加入PBS重懸菌體，混勻。然后超聲裂解菌體細胞，待菌液變清后，10 000 r/min離心10 min，收集上清，并向沉淀物中加入8 mol/L尿素，充分裂解。然后分別向收集好的上清和沉淀中加入蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min，快速放入冰浴中，適當時間后，進行SDS-PAGE分析。

1.4.4 重組蛋白的純化分析 參照“1.4.1”節的方法，分別利用蛋白的最優表達條件對重組蛋白表達至最優的時間，取50 mL離心管，稱量空管的質量并作記錄，倒入誘導的菌液，離心，棄上清，加入去離子水重懸沉淀，再次以同樣的條件離心，倒掉上清，稱量離心管質量，得到菌體濕質量，每100 mg菌體（濕質量）中加入2 mL細菌裂解液（每毫升細菌裂解液中預先加入10 μL蛋白酶抑制劑混合物），超聲破碎20 min，10 000 g低溫離心15 min，收集沉淀，將沉淀重懸于Binding Buffer中，盡量混勻使包涵體充分溶解。20 ℃靜置過夜，次日取出后，使用His（組氨酸）標簽蛋白純化試劑盒進行相關步驟純化，然后對純化蛋白進行 SDS-PAGE分析。

1.4.5 純化蛋白濃度的測定 使用BCA蛋白純化試劑盒對重組蛋白含量進行測定，具體步驟如下：

（1）按照表1依次向96孔板中加入相應試劑;

（2）將試劑盒中的A試劑與B試劑按照1 ∶ 50的比例配制BCA工作液，充分混勻;

（3）依次加入200 μL BCA工作液;

（4）將96孔板放在振蕩器上振蕩數秒，37 ℃孵育 30 min;

（5）在酶標儀上讀取D562 nm，以蛋白含量（μL）為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制標準曲線圖;

（6）選取合適的濃度稀釋gB蛋白，使其總體積為20 μL，加入BCA工作液200 μL，混勻，37 ℃放置30 min，以標準曲線0號管作參比，記錄562 nm下的吸光度;

（7）根據所得樣品的吸光度，在標準曲線上找出對應的蛋白含量，換算到原體積中，記錄蛋白的濃度。

1.4.6 純化蛋白的Western Blot分析 按照上述方法進行SDS-PAGE，電泳結束后，取出凝膠切下分離膠，標記方向，按照標準步驟進行蛋白質分子的轉印，150 mA恒流，4 ℃ 3 h，將凝膠上的蛋白質轉印到PVDF膜上。接著取出轉有蛋白質分子的PVDF膜，采用5%脫脂乳封閉2 h，一抗（IBR標準陽性血清）4 ℃雜交過夜，次日取出后使用PBST（加了吐溫的磷酸鹽緩沖液）洗滌5次，加入二抗（Rabbit Anti-Bov IgG/HRP）雜交1 h，去除非特異性結合，再次洗滌，條件同上。洗滌結束后，使用AEC（3-氨基-9-乙基咔唑）底物顯色試劑盒顯色 15 min，之后用蒸餾水終止反應，觀察并記錄結果。

2 結果與分析

2.1 重組蛋白gB的誘導表達及條件優化

將連接好的重組菌落接種于培養基上，利用IPTG初步探索誘導表達，經過SDS-PAGE分析，結果表明，未經IPTG誘導的重組菌并沒有出現特異性的條帶，而經IPTG于37 ℃ 誘導后的重組菌落出現了特異性的條帶，經分析其大小為32.4 ku，與預期的蛋白分子質量大小相符。為提高重組蛋白的表達效率，為以后大量制備蛋白奠定基礎，分別以不同時間和不同IPTG濃度進行誘導條件的優化。最后通過SDS-PAGE蛋白凝膠電泳檢測，由圖1、圖2顯示，蛋白的表達量在37 ℃ 0.5 mmol/L IPTG誘導4 h時達到最大值。

2.2 重組蛋白的可溶性分析

分別將重組菌落經過最優的表達條件表達，離心收集沉淀后超聲破碎，再次離心后對沉淀加尿素溶解，經SDS-PAGE分析，由圖3可見，表達gB蛋白以包涵體的形式存在。

2.3 重組蛋白的純化分析

由圖4可知，根據gB蛋白的表達特性和最佳誘導條件進行表達純化，得到1條約為32.4 ku的純度較高的條帶。

2.4 純化蛋白濃度的測定

以BSA標準蛋白濃度為橫坐標、吸光度D562 nm為縱坐標，制作標準曲線，見圖5。根據BSA濃度與D562 nm的線性關系，得到了擬合曲線方程：y=0.078 6x+0.065 6，r2=0.998 9。經測定，gB重組蛋白的濃度為1.84 mg/mL。

2.5 重組蛋白的Western Blot檢測

純化的gB蛋白經蛋白轉印、一抗二抗雜交，再經AEC顯色之后，出現了1條純度較高的目的條帶（圖6），提示表達的重組蛋白具有良好的反應原性。

3 結論與討論

IBR近年來已經成為影響牧業發展的主要病原，對于我國而言它屬于外來病原，首次發現該病在1980年，2005年我國在澳大利亞進口種牛中成功分離到該病毒[5]。2006年檢測了來自內蒙古等11個省份的疑似感染IBR血清樣本，結果顯示抗體陽性率為46.0%[6]。2015年北疆4個規模化奶牛場IBR感染性抗體的平均陽性率為87.4%[7]。2016年筆者所在團隊對寧夏地區進行IBR的抗體檢測，平均陽性率高達85.1%[8]。我國作為奶牛養殖業大國，但由于我國整體的養牛水平不太高，每年都要從一些養牛水平高的國家進口大批的牛，2015年Moore等的研究表明，澳大利亞出口的活牛IBR血清陽性率為39.0%[9]，這些數據均表明IBR感染的普遍性和嚴重性，我們應提高警惕避免該病發生大面積暴發。

gB蛋白是IBRV主要的抗原蛋白，在機體的免疫保護中起著至關重要的作用[10]。目前，IBRV的診斷試劑大多數均針對gB抗原表位。本研究采用筆者所在實驗室構建好的gB重組菌株，使用大腸桿菌的表達系統，大腸桿菌的表達系統以其高效表達的優點成為近些年來首選的表達系統[11]。相對于全基因表達，gB部分基因表達克服了蛋白表達量低、抗原性弱等缺點，目的蛋白在大腸桿菌表達系統中獲得了大量高效的表達。在選擇蛋白純化方法時，采用鎳柱親和層析法，方法簡便、利于操作及實驗室蛋白的大量純化，分離純化效果好，純化后的蛋白經免疫印跡檢測，能與IBR標準陽性血清發生特異性反應，說明表達的gB蛋白具有良好的反應活性，可被用來作為IBRV檢測的特異性抗原。

本研究成功獲得了IBRV gB蛋白，為應用建立IBR診斷方法和制備gB蛋白多抗和單抗，作為抗原免疫動物提供了重要的物質基礎和技術支持。

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