鹽酸米那普侖片微生物限度檢查方法的適用性驗證

瞿燕萍 吳青一

摘 要 目的：建立抗抑郁藥物鹽酸米那普侖片微生物限度檢查方法并對其進行驗證。方法：參照2015年版《中國藥典》四部通則，采用薄膜過濾法和平皿法測定鹽酸米那普侖片對金黃色葡萄球菌等5種試驗菌種的回收率，并對其進行了控制菌適用性試驗。結果：5種試驗菌回收率均在0.5～2.0范圍，控制菌可檢出。結論：本試驗所建立方法可用于鹽酸米那普侖片的微生物限度檢查。

關鍵詞 鹽酸米那普侖 驗證 微生物限度試驗

中圖分類號：R971.43； R927.11 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）19-0076-04

Validation of the applicability of microbial limit test for minapram hydrochloride tablets

QU Yanping*， WU Qingyi

（Shanghai Shyndec Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200137， China）

ABSTRACT Objective： To establish and verify the microbial limit test method for minapram hydrochloride tablets. Methods： According to the fourth part of the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia principles， the recovery rates of minapram hydrochloride tablets against 5 kinds of test microorganisms including Staphylococcus aureus were measured by membrane filtration and Petri dish methods， and the applicability test of E.coli as a control bacterium was also performed. Results： The recovery rates of the 5 kinds of experimental microorganisms were in the range of 0.5-2， and the control bacterium could be detected. Conclusion： The methods established in this experiment can be used for the microbial limit test of minapram hydrochloride tablets.

KEy WORDS minapram hydrochloride； verification； microbial limit test

米那普侖是一種新型的特異性5-HT和NE再攝取抑制劑（SNRI）。這類抗抑郁劑的療效可能較SSRI更好，同時又沒有TCA那樣的不良反應[1]。上?，F代制藥于2015年正式上市，鹽酸米那普侖被認為是目前對兩種神經遞質重吸收抑制作用最為均衡的SNRI類藥物，對5-羥色胺和去甲腎上腺素重吸收抑制的作用最接近1∶1（雙通道的再攝取抑制作用遠優于文拉法辛1∶30和度洛西汀1∶9）[2]。鹽酸米那普侖片微生物限度檢查包括需氧菌、霉菌和酵母，控制菌選取大腸埃希菌。所以，對于此類藥物，單用稀釋和加中和劑的方法很難使試驗菌（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌、白色假絲酵母菌、黑曲霉）的比值都達到藥典標準。為保障患者的用藥安全，確立可靠的微生物限度檢驗方法，本試驗參照2015年版《中國藥典》四部通則1105、1106非無菌產品微生物限度檢查微生物計數法、控制菌檢查法，對鹽酸米那普侖片微生物限度檢查方法進行了摸索與驗證[3]，發現稀釋液中加入中和劑不適用于鹽酸米那普侖片的適用性試驗，需采用定容法取上層液加薄膜過濾法可有效地去除其有效成分對測定的干擾。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

鹽酸米那普侖片（規格25 mg，批號180601，上?，F代制藥股份有限公司）；pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液（批號170801，上海盛思生化科技有限公司）；蛋黃卵磷脂（批號180324，博飛美科試劑）；吐溫80（批號20131016，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 培養基與菌種

胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養基（TSB）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）、麥康凱瓊脂培養基、麥康凱液體培養基（批號分別為170801、171109、180103、161201、160701，上海盛思生化科技有限公司）。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， CMCC（B）26003）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa， CMCC（B）10104）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis， CMCC（B）-63501）、白色假絲酵母（Candida albicans， CMCC（F）-98001）、黑曲霉（Aspergillus niger， CMCC（F）-98003）和大腸埃希菌（Escherichia coli， CMCC（B）44102）均來自于中國食品藥品檢定研究院。

1.3 實驗儀器

LRH-150生化培養箱、GNP-9160隔水式恒溫培養箱（上海齊欣科學儀器有限公司）；S20 pH酸度計（梅特勒托利多儀器（上海）有限公司）； HT-600N電子天平（成都普瑞遜電子有限公司）；YXQ-LS-75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；1300 SERIES A2生物安全柜（賽默飛世爾科技公司）；YX940D電動吸引器（上海醫療器械公司醫用吸引器廠）；JYD-400N均質器（上海之信儀器有限公司）。

1.4 實驗方法

參照2015年版《中國藥典》四部通則[3]對鹽酸米那普侖片進行需氧菌總數、霉菌和酵母總數、控制菌檢查方法的確認。

1.5 菌液的制備

參照2015年版《中國藥典》四部通則[3]1105微生物計數法項下方法制備菌液。革蘭陽性菌須稀釋10-3～10-7倍，使菌落數不大于100 cfu/ml。

1.5.1 供試液的制備

1）供試液1（1∶10） 取鹽酸米那普侖片10 g，粉碎，移至一次性無菌袋中，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 ml中，拍打器拍打1 min（拍打速率為12/min）。

2）供試液2（1∶20） 取供試液1 100 ml，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 ml中，混勻，即得。

3）供試液3（1∶10） 取鹽酸米那普侖片10 g，粉碎，移至一次性無菌袋中，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（內含0.3%卵磷脂與3%吐溫80）100 ml中，拍打器拍打1分鐘（拍打速率為12/min）。

1.5.2 計算公式及接受標準

試驗組比值=（試驗組菌落數-供試品對照組菌落數）/菌液對照組菌落數。所得比值均應在0.5～2.0范圍內。

1.5.3 需氧菌總數計數方法驗證

1）需氧菌計數方法的確定（預試驗） 以金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和銅綠假單胞菌為試驗菌。分別采用a，b，c，d，e 5種方法對供試品進行處理。①方法a：取1 ml供試液1（1∶10）平皿法測定；②方法b：取1 ml用定性濾紙過濾的供試液3（1∶10）平皿法測定；③方法c：取1 ml用定性濾紙過濾的供試液3（1∶10），采用pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液1 000 ml薄膜過濾沖洗（最后沖洗100 ml時加入菌懸液）；④方法d：取1 ml供試液3（1∶10），采用pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液1 000 ml薄膜過濾沖洗（最后沖洗100 ml時加入菌懸液）；⑤方法e：取1 ml供試液2（1∶20）上層液，采用pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液1 000 ml薄膜過濾沖洗（最后沖洗100 ml時加入菌懸液）。

2）方法驗證 分別取一批供試品按方法e進行處理，采用薄膜過濾法進行三次平行試驗。①試驗組：取供試液2（1∶20）1 ml薄膜過濾，沖洗時加入1 ml菌液（<100 cfu/ml），濾干，于胰酪大豆胨瓊脂（TSA）平板上培養；②供試品對照組：不加入菌液的供試液，測定供試品微生物數；③菌液對照組；取稀釋液替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進行回收試驗。

1.5.4 霉菌和酵母菌總數計數驗證

1）霉菌和酵母菌計數方法的確定（預試驗） 以白色假絲酵母和黑曲霉菌為試驗菌。分別采用分別采用f，g，h 3種方法對供試品進行處理。①方法f：取1 ml供試液1（1∶10）平皿法測定；②方法g：取1ml用定性濾紙過濾的供試液3（1∶10）平皿法測定；③方法h：取1 ml供試液1（1∶10）上層液平皿法測定。

2）方法驗證 分別取一批供試品按方法h進行處理，采用平皿法進行三次平行試驗。①試驗組：取供試液1（1∶10）1 ml，立即傾注于沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）培養基平板中，培養；②供試品對照組：不加入菌液的供試液，測定供試品微生物數；③菌液對照組；取稀釋液替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進行回收試驗。

1.5.5 控制菌驗證試驗

以大腸埃希菌作為控制菌采用平皿法進行操作。①試驗組：取供試液2（1∶20）20 ml，采用pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液1 000 ml薄膜過濾沖洗，取濾膜置100 ml TSB中，混勻，同時加入大腸埃希菌菌懸液1 ml混合均勻；②陰性對照組：取TSB 100 ml，不加入樣品和菌懸液；③菌液組：取TSB 100 ml加入大腸埃希菌菌懸液1 ml混合均勻。均按藥典方法培養，以接入試驗組的大腸埃希菌被檢出為接受標準。

2 結果

2.1 需氧菌總數計數方法的預實驗

五種預實驗結果表明，方法e可用于需氧菌總數的計數。

2.2 需氧菌總數計數方法驗證

按照方法e對一批供試品進行平行三次驗證試驗，結果表明采用方法e可用于鹽酸米那普侖片需氧菌總數計數（表2）。

2.3 霉菌和酵母菌總數的預實驗

三種預實驗方法試驗結果表明，方法h可用于霉菌和酵母菌總數的計數。

2.4 霉菌和酵母菌總數方法驗證

按照方法h對一批供試品進行平行三次驗證試驗，結果表明采用方法f可用于鹽酸米那普侖片霉菌和酵母菌總數計數（表4）。

2.5 控制菌驗證試驗

控制菌選用稀釋10-6倍的大腸埃希菌，一批供試品進行平行三次驗證，試驗結果表明，適用性試驗符合標準（表5）。

3 討論

通過上述一系列試驗，成功摸索出了適合鹽酸米那普侖片的微生物限度控制方法，本次驗證試驗中需要注意的兩點：①樣品在pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中溶解后需放置至上層液盡量清澈后再吸取供試液進行試驗；②在進行薄膜過濾時濾膜盡量抽濾充分后進行培養，防止菌落出現連片現象，從而影響計數觀察。

微生物限度檢查是判斷藥品受到微生物污染的程度，是企業從原料到成品生產全過程進行微生物評價的主要依據，同時也是藥品安全性檢查的重要項目[4-6]。檢查方法中干擾因素較多，易影響計數結果，如培養條件、培養基、加菌濃度及加菌量等[7-8]。本次驗證中鹽酸米那普侖片是抗抑郁類藥物，也具有一定的抑菌作用，通過各種處理，確定消除藥品的抑菌性后再進行微生物限度檢查是檢驗方法篩選的基本原則[9]，但由于在預實驗中中和劑的加入影響了平皿的觀察計數，故舍棄中和劑。若因沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用而導致微生物回收的失敗，應采用能使微生物生長的更高稀釋級供試液進行方法適用性試驗[3]，故在此次驗證中通過提高稀釋倍數+薄膜過濾來進行驗證。

參考文獻

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