綠色熒光蛋白標記植物乳桿菌及其生物學特性分析

陳彩玲，毛丙永，崔樹茂，趙建新

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

乳桿菌不僅能夠通過發酵提高食品的營養價值，改善食品風味[1-2]，而且能夠調節腸道菌群、保持微生態平衡、增強機體免疫作用[3-4]。目前乳桿菌的研究大多關注宿主的生理、疾病以及菌群等的變化，對于其在胃腸道中的分布、數量、運動及它們的定植情況缺乏系統性、針對性的機理研究。王晶等[5]的研究表明,無法真正區分進入腸道的菌屬于內源菌還是外源菌，因此這在一定程度上限制了對作用機理的深入研究。

關于菌株定植能力的研究，一般選擇小鼠、人體、模擬反應器等實驗模型[6-8]，灌胃或飲食的方式攝入，收集糞便或腸道內容物后通過平板培養[9]、熒光原位雜交[10]和實時熒光定量PCR[11]，但這些技術存在著操作繁瑣、準確度低或費用高等缺陷。近年來，綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)作為一種理想的活體熒光標記分子，越來越多地被用于活細胞或微生物的定位、結構和動力學的研究[12]。GFP已經在許多細菌中完成了轉化，王晶等[13]利用GFP追蹤了乳酸乳球菌WH-C1在小鼠腸道內的定植情況；YU等[14]通過GFP標記發現德氏乳桿菌D17嵌入在黏液層中，局部接近腸道的上皮細胞；GEOFFROY等[15]構建了含有GFP的組成型和Nisin誘導型的質粒并導入植物乳桿菌WCFS1中，用來研究WCFS1在腸道內的定植與分布。

本實驗室從發酵食品中分離得到1株有明顯益生作用的植物乳桿菌CCFM8610，動物實驗發現CCFM8610處理可有效降低腸道鎘的吸收，減少組織中鎘的積累，減輕腎臟和肝臟的氧化應激[16]。為進一步研究該菌株在腸道內的定植規律，本實驗室成功對包括CCFM8610在內的4株植物乳桿菌進行GFP熒光標記。本研究對這4株植物乳桿菌的出發菌株和重組菌株的生物學特性進行了比較研究，為植物乳桿菌在腸道中分布和定植規律的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株

試驗用植物乳桿菌分離自發酵食品和健康人糞便，保藏于江南大學食品生物技術菌種保藏中心；所用菌株、質粒及引物見表1。

1.2 培養基及試劑

MRS培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，K2HPO42 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉2 g，吐溫80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.5 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.4，固體培養基添加1.5%的瓊脂粉，在115℃滅菌20 min。培養重組菌株的培養基中，添加終質量濃度為10 μg/mL的氯霉素，以0.22 μm無菌濾膜過濾。

TIAN prep Mini Plasmid kit聚合酶、TaqDNA聚合酶,上海科晴生物科技有限公司；所有抗生素類試劑、胃蛋白酶,生工生物工程(上海)股份有限公司；膽鹽,英國Oxoid公司；其他實驗用化學試劑,國藥集團化學試劑有限公司。

表1 本研究所用菌株、質粒及引物Table 1 Strains, plasmids and primers used in this study

PBS緩沖液：Na2HPO42.13 g，NaCl 0.8 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.2 g，攪拌溶解后，調pH值到7.4，定容至1 L，在115℃ 滅菌20 min，配方參考文獻[18]。

乳桿菌感受態細胞制備和電轉化溶液：溶液I：136.7 g山梨醇，0.1 g甘氨酸，用MRS培養基定容至1 L，115℃滅菌20 min；溶液Ⅱ：342.3 g蔗糖，0.711 g MgCl2·6H2O，去離子水定容至1 L，115℃滅菌20 min；復蘇液(SMRS)：136.7 g山梨醇，1.11 g CaCl2，9.52 g MgCl2，用MRS培養基定容至1 L，115℃滅菌20 min，配方參考文獻[18]。

模擬胃液(simulated gastric fluid，SGF)和模擬腸液(simulated intestinal fluid,SIF)：SGF∶將胃蛋白酶(1∶10 000)溶于滅菌的生理鹽水(9 g/L，HCl調pH值至3.0)中，使終質量濃度為3 g/L。以0.22 μm無菌濾膜過濾，現配現用；SIF∶將胰蛋白酶(1∶250)溶于滅菌的生理鹽水(9 g/L，NaOH調pH值至8.0)中，使終質量濃度為1 g/L，并加入膽鹽使終質量濃度為3 g/L，以0.22 μm無菌濾膜過濾，現配現用，配方參考文獻[19-20]。

1.3 儀器與設備

隔水式恒溫培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；振蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司； UV1800紫外可見分光光度計，日本島津；ZHJH-C1115B超凈工作臺，上海智誠分析儀器制造有限公司；DM 2000熒光顯微鏡，徠卡儀器(德國)有限公司；T100 Thermal Cycler PCR儀、Universal Hood 2凝膠成像儀，美國伯樂BIO-RAD；多功能微孔板讀數儀，美國賽默飛世爾科技公司；電轉化儀，德國Eppendorf。

1.4 植物乳桿菌感受態細胞制備

按照范璟等[21]先前描述的方法，將活化好的植物乳桿菌，按照1%的接種量接種到新鮮的MRS液體培養基中，37℃ 培養過夜；按照2%的接種量接種到10 mL溶液I中，37℃ 培養3 h左右，至OD600≈0.5；5 000×g，4 ℃離心2 min，收集菌體細胞；用2 mL預冷的溶液Ⅱ洗滌細胞，5 000×g，4 ℃離心2 min，去除上清液，反復洗滌2次；最后用1 mL冰浴的溶液Ⅱ重懸菌體細胞，用于電轉化植物乳桿菌。

1.5 植物乳桿菌電轉化方法

方法參考文獻[22]，將無菌電轉化杯從-20 ℃的冰箱取出后，于冰上預冷；取50 μL冰浴的感受態細胞，加入5 μL質粒溶液，輕輕吹吸混勻，于冰上靜置10 min；將上述混合液轉移至電轉化杯，冰浴10 min；設置參數：電壓2 000 V，電容為25 μF，電阻為400 Ω。電轉化杯迅速擦干后，放入電擊槽中，進行電擊；迅速向轉化后的電轉化杯中加入950 μL預冷的SMRS溶液，冰上靜置5 min；將上述液體轉移進無菌的1.5 mL離心管中，37 ℃靜止培養3 h左右，將培養液涂布到含有10 μg/mL氯霉素的MRS固體平板上，37℃ 培養48 h，長出的菌落即為轉化子。

1.6 PCR驗證

菌株按照5 000×g1%的接種量，培養到穩定期，取1 mL培養液5 000×g，離心2 min，去除上清，用無菌水洗2遍，再用500 μL無菌水重懸，作為模板。以重組菌株和陰性菌株的菌落為模板，利用引物GF、GR擴增GFP基因片段，PCR體系20 μL：2×Taq Mix 10 μL；ddH2O 8 μL；上游引物(25 μmol/L) 0.5 μL；下游引物(25 μmol/L) 0.5 μL；模板DNA 1 μL。PCR擴增條件為：95℃預變性5 min；95℃變性10 s；48℃退火30 s；72℃延伸1 min；72℃延伸5 min，2～4步進行30個循環，PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.7 倒置熒光顯微鏡觀察

按照曹春蕾等[23]描述的方法，挑取重組菌株接種于含10 μg/mL氯霉素的MRS液體培養基中，37℃培養過夜；按照1%的接種量接種到新鮮的培養基中，37℃培養18 h；5 000×g離心2 min，收集菌體細胞，用PBS洗滌2遍，重懸在PBS中；制片后，用熒光顯微鏡觀察。

1.8 熒光強度測定

方法參考文獻[18]，同樣按照1.7的方法收集菌體細胞，將菌體細胞重懸于PBS中，取200 μL重懸液加入96 孔酶標板中，測定488 nm激發、535 nm發射下的熒光值。

1.9 生長曲線測定

將標記前后的菌株，按照1%的接種量接種到新鮮培養基中，37 ℃培養過夜；將培養液按照1%的接種量接種到新的MRS液體培養中，混勻后分裝到提前滅過菌的試管中，于37 ℃恒溫靜置培養，每隔1 h取出1根試管測定OD600的吸光值和熒光強度，以培養時間為橫坐標，分別以OD600值、熒光強度為縱坐標繪制曲線。

1.10 胃酸和膽鹽耐受性試驗

按照RANADHEERA等[19]先前描述的方法對標記前后的植物乳桿菌進行模擬胃液(SGF)和模擬腸液(SIF)。將活化好的菌株按照1%的接種量接種到新鮮的培養基中，于37℃恒溫靜置培養至OD600≈2.5，8 000×g，離心5 min收集菌體細胞；將樣品暴露于模擬胃液2 h，取樣進行一式兩份的連續稀釋和傾注計數，以確定總活菌數；然后將樣品暴露于模擬腸液4 h，同樣進行計數，以確定總活菌數，以活菌數和存活率為縱坐標，以不同處理方式為橫坐標作圖。

1.11 -80℃凍存2周活菌計數

按照方法1.7收集菌體細胞，并將細胞重懸于300 g/L的蔗糖的溶液中，放置于-80℃；隔1周取1次樣，進行一式兩份的連續稀釋和傾注計數，以確定總活菌數，以活菌數和熒光強度為縱坐標，以時間為橫坐標作圖。

1.12 低聚果糖利用能力的測定

按照方法1.7收集菌體細胞，重懸于PBS中。用滅菌后的牙簽蘸取少量的菌液，分別輕輕點在葡萄糖作為唯一碳源的MRS平板和低聚果糖(fructooligosaccharide，FOS)作為唯一碳源的平板上，與于37℃恒溫靜置培養20 h后，觀察顏色變化。本次試驗，培養基中添加質量濃度為5 g/L的溴甲酚紫溶液做為指示劑，添加量為15 mL/L。

1.13 抗生素對微生物生長的最低抑制濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)

方法參考國際標準ISO 10932∶2010(IDF 223∶2010)。無菌操作，將倍比稀釋后不同濃度的抗生素溶液分別加到無菌的96孔聚苯乙烯板中，第2～11孔按照濃度由低到高加抗生素稀釋液，每孔100 μL，第12孔不加抗生素作為生長對照。按照規范將培養到穩定期的菌液稀釋到105～106CFU/mL，吸取100 μL菌液加到96孔板中。37℃厭氧培養48 h后，酶標儀測定OD625，計算結果。

1.14 數據分析

本研究所有數據分析均由GraphPad Prism 6、SPSS 19.0以及Origin 9處理完成；2組之間的顯著性差異通過卡方檢驗進行判斷(SPSS 19.0 軟件)，P<0.05 則認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 GFP標記植物乳桿菌

通過電轉化的方法將質粒PCD4033-GFP導入到植物乳桿菌感受態受體中，獲得GFP標記的菌株，并進一步對轉化子進行篩選鑒定及熒光檢測。

2.1.1 質粒PCD4033-GFP電轉化后重組菌株的篩選

將質粒PCD4033-GFP通過電轉化的方法導入植物乳桿菌感受態受體細胞后，添加氯霉素的MRS中篩選轉化子。陰性對照在MRS平板上長出菌落,在氯霉素平板上沒有長出菌落，轉化成功的轉化子在氯霉素的平板上長出菌落。初篩的結果表明,質粒PCD4033-GFP已成功轉入4株植物乳桿菌中。

2.1.2 重組菌株驗證

以重組菌株和陰性菌株的菌泥為模板，利用引物GF、GR擴增GFP基因片段，PCR產物電泳結果如圖1所示,陰性對照均沒有條帶，所有重組菌株在700 bp附近有1條很明顯的條帶，GFP基因片段714 bp，條帶與目的片段大小吻合，所以驗證結果表明GFP已成功標記4株植物乳桿菌。

圖1 PCR產物電泳結果Fig.1 Electrophoresis result of PCR products注：M-marker；Y-無菌水陰性對照；1、2、3、4-P1、P2、P3、P4的標記后的菌株；5、6、7、8-P1、P2、P3、P4陰性對照。

2.1.3 熒光顯微鏡觀察

將上述轉化菌株用熒光顯微鏡觀察，自然光下即可見微弱的綠色熒光，在紫外燈下轉化菌株菌體發出明亮的綠色熒光，細菌形狀成桿狀。表明質粒PCD4033-GFP已成功轉入植物乳桿菌中，且GFP成功表達。

2.2 生物學特性比較研究

2.2.1 生長曲線及不同生長階段熒光強度的測定

標記前后菌株的生長曲線如圖2所示。在相同的生長環境下，所有菌株標記前后的生長曲線的變化趨勢基本相同。P1和P1G的生長曲線幾乎吻合，OD600最終均達到7.2左右；P3和P3G的生長曲線完全一致，OD600最終均達到4.2左右；P2G和P4G的生長速度比標記前略有滯后，但P2和P2G的OD600最終穩定在4.0左右，P4和P4G穩定在7.4左右。在王晶等[24]的研究中也發現標記后的菌株出現生長略微滯后的現象。綜上，GFP基因標記對植物乳桿菌生長幾乎不影響。

對于熒光強度，轉化后的這4株植物乳桿菌的熒光強度隨著時間變化的趨勢基本一致(圖2)。指數期前期熒光強度隨著吸光度的增加而顯著增加，當吸光度在2.5～3.0，熒光強度達到最大值。隨后，熒光強度隨著吸光度的增加顯著降低至一個穩定的水平；對于熒光強度的最高水平，不同的菌株之間存在一定的差異，其中熒光強度相對較高的是P4G，大約為25。

a-P1、P1G;b-P2、P2G;c-P3、P3G;d-P4、P4G圖2 標記前后菌株的生長動力學曲線及不同生長階段的熒光強度Fig.2 Growth curve of wild strains and labeled strains and fluorescence intensity at different growth stages

2.2.2 胃酸耐受性和膽鹽耐受性的測定

乳酸菌經口服進入機體后，只有能夠抵抗較強的胃酸和膽鹽，才能在腸道中存活繼而發揮其益生功效[25]。圖3可以看出, P1、P2、P4標記前后的菌株在模擬胃液3 h后，依然保持85%～100%的高存活率，表現出良好的胃酸耐受性；P3標記前后的菌株在模擬胃液3 h后存活率均顯著降低。但在模擬腸液4 h后，所有的菌株存活率顯著降低，其中存活率相對較高的P1、P2、P3標記前后的菌株，存活率也只有5%～10%，所有菌株對膽鹽的耐受性都比較弱，但是，所有菌株標記前后對胃酸和膽鹽的耐受性沒有顯著差別(P>0.05)。

a-P1;b-P2;c-P3;d-P4圖3 標記前后菌株的酸耐受性和膽鹽耐受性的結果Fig.3 The tolerance to acid and bile salts of wild strains and labeled strains

2.2.3 凍存前后的活菌數及熒光強度的變化

由圖4可知，被GFP標記前和標記后的菌株在凍存的2周內，活菌數和熒光強度均沒有顯著性變化(P>0.05)。對于活菌數，凍存期間所有菌株基本維持在10.5 lgCFU/mL左右。對于熒光強度，P2G、P3G、P4G均維持在一個穩定的水平，凍存前后沒有明顯的變化；P1G的熒光強度在第2周時有輕微的上調，但與凍存前和凍存1周的結果比較并沒有顯著的差異(P>0.05)。所以-80℃凍存2周對于標記前后植物乳桿菌的活菌數和熒光強度沒有影響。

a-P1；b-P2；c-P3；d-P4圖4 凍存期間活菌數及熒光強度的變化Fig.4 Results of viable cell count and fluorescence intensity after cryopreservation

2.2.4 對低聚果糖(FOS)利用能力的測定

標記前后的菌株對FOS利用情況如表2所示。P1、P2、P4標記前后的菌株接種到葡萄糖平板和FOS平板，培養20 h后，平板均由紫色變成了黃色，所以P1、P2、P4標記前后均可以利用葡萄糖和FOS。P3標記前后的菌株接種到葡萄糖平板上，培養20 h后紫色變成了黃色；接種到FOS平板上培養，沒有黃色產生，綜上可知，P3標記前后都不具備利用FOS的能力。綜上可知，GFP基因標記植物乳桿菌后不影響菌株對FOS的利用能力。

表2 標記前后的菌株對FOS利用情況Table 2 The use of FOS by wild strains and labeled strains

注：+表示可以利用；-表示不能利用。

2.2.5 抗生素最低抑制濃度(MIC)測定

由表3可知除了氯霉素外，轉化前和轉化后菌株的各種抗生素的MIC基本相同，所以轉化幾乎不影響菌株對抗生素的耐受性。氯霉素存在顯著差異的原因是，表達載體里的選擇標記基因是氯霉素的抗性基因，所以標記后的菌株都具備氯霉素的抗性。結果表明，除氯霉素外，GFP基因標記植物乳桿菌，不影響菌株對抗生素的敏感性。

3 結論

通過熒光顯微鏡觀察，發現4株菌在紫外燈下發出明亮的綠色熒光，表明用GFP基因成功標記了4株植物乳桿菌，而且GFP的表達量在不同的植物乳桿菌中存在差異，在P4G中的表達量最高(≈25)。標記前后，P1和P3的生長曲線幾乎吻合，P2和P4被GFP標記后生長略有滯后，但趨勢基本相同，表明GFP標記不影響植物乳桿菌的生長情況，GORY等[26]發現Lactobacillussake被GFP標記后，生長略有滯后，正常生長不受影響。P1、P2、P4這3株植物乳桿菌標記 前后的菌株，經過3 h模擬胃液存活率均高于85%，P3和P3G的存活率分別是65%和61%，所有菌株經過4 h的模擬腸液后存活率均低于11%，結果表明GFP標記不影響植物乳桿菌對胃酸和膽鹽的耐受性(P>0.05)，此結果與王晶等[27]的研究結果一致。在-80℃凍存的2周內，所有植物乳桿菌的活菌數均沒有顯著性變化(P>0.05)，表明GFP標記不影響植物乳桿菌對低溫的耐受性，可以一次性制備菌體凍存于-80℃供動物實驗用。FOS利用能力的實驗發現，P1、P2、P4標記前后均可以利用FOS，但是P3和P3G均不具備FOS利用的能力，表明GFP標記不影響植物乳桿菌對FOS的利用能力。從抗生素最低抑制濃度的實驗結果可以看出，標記后4株植物乳桿菌對氯霉素具有抗性，對其他抗生素的敏感性幾乎沒有變化，這是因為在重組過程中帶入了氯霉素抗性基因作為標記基因[18-19]，所以GFP標記不影響植物乳桿菌對抗生素的敏感性，王晶等[27]發現GFP標記不改變植物乳桿菌對除紅霉素外其他藥物的耐藥性，表達載體的標記基因選擇的是紅霉素。

表3 抗生素對微生物生長的最低抑制濃度 單位：μg/mL

注：R表示耐受，數字表示最低耐受濃度。

綜上，植物乳桿菌被GFP標記后的生物學特性具有穩定性，為利用GFP基因標記植物乳桿菌評價其定植能力和作用機理解析奠定了基礎。