γ-干擾素酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法聯(lián)合結(jié)核菌素試驗(yàn)在附睪結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值

劉建華, 崔振鵬, 張禮軍, 李軍孝, 陳其亮

(1. 陜西省結(jié)核病防治院, 陜西 西安, 710100; 2. 兵器工業(yè)五二一醫(yī)院, 陜西 西安, 710065;3. 湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院, 湖北 恩施, 445000)

附睪結(jié)核是目前臨床上最常見的男性生殖系統(tǒng)結(jié)核，附睪結(jié)核的主要后遺癥是附睪管和近端輸精管不完全或完全梗阻，可表現(xiàn)為少精或無精等癥狀，進(jìn)而導(dǎo)致不育，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1-3]。附睪結(jié)核的診斷一般無太大困難，若有典型的附睪硬結(jié)及串珠樣輸精管病變，即可做出診斷[4]。但早期和急性發(fā)作的附睪結(jié)核易誤診，與慢性附睪炎急性發(fā)作等非結(jié)核性疾病難以鑒別，影響附睪結(jié)核的早期治療[5]。γ-干擾素(IFN-γ)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)聯(lián)合結(jié)核菌素試驗(yàn)是一種全新的結(jié)核診斷方法。本研究探討IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法聯(lián)合結(jié)核菌素試驗(yàn)在附睪結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究獲得全體患者的知情同意，并被本院的倫理委員會(huì)批準(zhǔn)認(rèn)可。實(shí)驗(yàn)操作前要求患者簽署知情同意書，完善相關(guān)資料。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 能配合檢查者; ② 經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)附睪結(jié)核患者; ③ 無嚴(yán)重肝、腎功能障礙者; ④ 知情同意者; ⑤ 可長(zhǎng)期隨訪者。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 患者精神狀態(tài)欠佳，不能配合相關(guān)工作; ② 生殖器畸形; ③ 意識(shí)或精神障礙。共選取經(jīng)手術(shù)治療且病理結(jié)果證實(shí)為附睪結(jié)核患者90例，年齡22～41歲，平均(29.10±12.40)歲; 病程1～4年，平均為(3.40±1.10)年。根據(jù)診斷方法將患者分為A組(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法)、B組(結(jié)核菌素試驗(yàn))、C組(IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法聯(lián)合結(jié)核菌素試驗(yàn))，每組30例。3組患者的年齡、病程等一般資料比較無顯著差異(P>0.05), 具有可比性。

1.2 方法

ELISPOT試劑由深圳市達(dá)科為生物技術(shù)有限公司提供，為國產(chǎn)試劑。純蛋白衍生物(PPD)由成都生物制品研究所提供。A組行IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法: 采集10 mL靜脈血，使用乙二胺四乙酸(EDTAK2)抗凝, 2 h以內(nèi)將采集的血液標(biāo)本常規(guī)分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC), 共洗滌2次，在ELISPOT培養(yǎng)板中預(yù)包被抗-IFN-γ抗體，板中每個(gè)孔加入100 μL的細(xì)胞懸液，每孔的細(xì)胞數(shù)大約為2.0×105。于陽性對(duì)照孔內(nèi)每孔加入植物血凝素(PHA), 濃度為5 μg/mL, 于陰性對(duì)照孔的各孔中，拒絕添加刺激物。在實(shí)驗(yàn)孔中分別加入終濃度均5 μg/mL的特異性抗原刺激物: PoolB、ESAT-6﹑PoolA。將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h。2 h后洗板，加入生物素化的抗IFN-γ, 溫育1 h。繼續(xù)使用親和素標(biāo)記二抗后持續(xù)孵育1 h, 加底物液顯色。待顯色洗板后，使用自來水終止反應(yīng)，在顯微鏡下或用ELISPOT測(cè)定儀計(jì)斑點(diǎn)數(shù)，記錄分析斑點(diǎn)的數(shù)量。

B組行結(jié)核菌素試驗(yàn)法: 采用皮內(nèi)注射法。配皮試液: 先吸PPD原液0.1 mL備用，另吸PPD原液0.2 mL, 加0.9%氯化鈉注射液稀釋至0.4 mL備用。PPD的用量: 第1次試驗(yàn)液為每0.1 mL中含有0.000 1 mg。OT一般首次使用1∶10萬倍稀釋液。常規(guī)消毒后在患者上肢前臂行皮內(nèi)注射 0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)PPD(20個(gè)國際結(jié)素單位/mL)。2～3 d后觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，注意局部有無硬結(jié)，不可單獨(dú)以紅暈為標(biāo)準(zhǔn)。記錄硬結(jié)直徑，取平均值。C組行IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法聯(lián)合結(jié)核菌素試驗(yàn)。各組患者均行常規(guī)的檢查及相關(guān)化驗(yàn)(血生化檢查、心電圖、血尿便常規(guī)、靜脈腎盂造影、陰囊彩超、胸部正位片、肝膽脾胰腎彩超)。

1.3 觀察指標(biāo)

ELISPOT檢測(cè)結(jié)果: 結(jié)果判定參照國產(chǎn)ELISPOT試劑的閾值標(biāo)準(zhǔn)，據(jù)斑點(diǎn)數(shù)量設(shè)定，每孔中斑點(diǎn)數(shù)目排除陰性孔中的斑點(diǎn)數(shù)則為檢測(cè)的結(jié)果，斑點(diǎn)數(shù)量≥30為陽性結(jié)果，若Poo lB、ESAT-6、Poo lA這3種抗原中至少有1種抗原的檢測(cè)結(jié)果是陽性，結(jié)果判為陽性; 若3種抗原的測(cè)試結(jié)果都顯示陰性，結(jié)果判定為陰性。

PPD試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果: 判定采用中國的通用標(biāo)準(zhǔn)。測(cè)量PPD局部反應(yīng)出現(xiàn)的紅腫硬結(jié)的橫徑和縱徑，取平均值，依據(jù)硬結(jié)的平均直徑判斷結(jié)果: 直徑≥5 mm為陽性, <5 mm則為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用百分率(%)表示。兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

C組附睪結(jié)核診斷陽性率高于A組、B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 3組診斷附睪結(jié)核陽性率比較

與C組比較, *P<0.05。

3 討 論

附睪結(jié)核疾病發(fā)展一般較為緩慢，附睪逐漸腫大，無明顯疼痛，多見于中青年男性，因附睪結(jié)核早期的癥狀隱匿，病程緩慢，未受到患者的足夠重視，以至于不能及時(shí)采取有效的治療措施[6]?；颊叨嘁蚣膊“l(fā)展至后期引起其他臟器結(jié)核，導(dǎo)致雙側(cè)附睪切除，喪失自然生育能力。若能在疾病早期提高對(duì)附睪結(jié)核的診斷陽性率，特別是不典型病例的早期診斷，則能有效提高患者的生活質(zhì)量[7-10]。IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法和結(jié)核菌素試驗(yàn)?zāi)軐?duì)附睪結(jié)核的早期診斷提供一定的依據(jù)[11-13]。

本研究采用的ELISPOT既可對(duì)分泌不同細(xì)胞因子的人體細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，還能夠檢測(cè)產(chǎn)生不同類型抗體的B細(xì)胞及釋放抗原的細(xì)胞，同時(shí)操作上具有簡(jiǎn)便、可重復(fù)的特性，可以對(duì)治療前后的2種標(biāo)本進(jìn)行平行測(cè)試，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)可行，可進(jìn)行回顧性和前瞻性研究，新鮮與冷凍的標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果基本相同。這種診斷附睪結(jié)核的檢測(cè)方法，根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)及相關(guān)研究[14-15]證實(shí)，相對(duì)于傳統(tǒng)的ELISA檢測(cè)和細(xì)胞內(nèi)染色效果更敏感，結(jié)果更明確，被廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)結(jié)核操作。因檢查對(duì)結(jié)核具有高敏感性、高特異性等特點(diǎn)，并可以排除卡介苗干擾，所以部分學(xué)者將其視為結(jié)核菌素皮試的“升級(jí)版”，成為目前特異性最高的檢測(cè)結(jié)核的方法。本研究中, ELISPOT檢查結(jié)果為陽性23例(73.33%), 與病理結(jié)果大致相符。

本研究中，將患者血液細(xì)胞分泌產(chǎn)生的細(xì)胞因子使用抗體捕獲并培養(yǎng)，繼而采用酶聯(lián)斑點(diǎn)顯色的操作方式將其表現(xiàn)出來，原理為特異性抗原刺激T淋巴細(xì)胞后，產(chǎn)生細(xì)胞因子，包被于膜的特異單克隆抗體捕獲細(xì)胞因子，被捕獲的細(xì)胞因子先與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，繼而與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合，由BCIP/NBT底物現(xiàn)色后，細(xì)胞若產(chǎn)生細(xì)胞因子將會(huì)在孔底出現(xiàn)紫色斑點(diǎn)。此檢測(cè)方法在附睪結(jié)核的診斷陽性率較高，但仍然在早期診斷中存不足: ELISPOT對(duì)條件要求嚴(yán)格，結(jié)果容易導(dǎo)致偏差，且在抗原刺激及細(xì)胞培養(yǎng)過程中，如有細(xì)菌污染實(shí)驗(yàn)，則將導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)失敗，且操作流程要求嚴(yán)格，實(shí)驗(yàn)材料費(fèi)用較高，不宜二次操作[15-16]。本實(shí)驗(yàn)通過將IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法和結(jié)核菌素試驗(yàn)兩種方法聯(lián)合檢測(cè)，彌補(bǔ)檢驗(yàn)操作上的不足，提高附睪結(jié)核早期診斷的陽性率。

結(jié)核菌素試驗(yàn)對(duì)患者附睪結(jié)核病的早期診斷和鑒別有重要作用，是臨床上較為重要的輔助檢查方法。本研究中，通過皮內(nèi)注射結(jié)核菌素，依據(jù)患者注射部位的皮膚硬結(jié)反應(yīng)結(jié)果診斷由結(jié)核桿菌感染所致Ⅳ型超敏反應(yīng)的附睪結(jié)核。本研究中，單獨(dú)采用PPD 檢測(cè)附睪結(jié)核的陽性率僅有70.00%，原因可能為結(jié)核菌素是結(jié)核桿菌的菌體成分，包括舊結(jié)核菌素(OT)和PPD。附睪結(jié)核的致病菌為結(jié)核桿菌，PPD 原理是科赫現(xiàn)象，其抗原是由 200 多種蛋白組成的結(jié)核桿菌培養(yǎng)物過濾液粗提的濃縮物，很多成分與卡介苗(BCG)及非結(jié)核分枝桿菌(NTM)相同，故PPD對(duì)眾多成分如BCG及 NTM 在內(nèi)等較敏感。中國兒童出生時(shí)常規(guī)行卡介苗接種，導(dǎo)致結(jié)果假陽性率較高，嚴(yán)重影響臨床對(duì)早期結(jié)核的診斷。因此該試驗(yàn)對(duì)診斷附睪結(jié)核病僅具有參考意義，但不能對(duì)附睪結(jié)核的早期診斷給出確診的依據(jù)[17-18]。

本研究將酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法與結(jié)核菌素試驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用，附睪結(jié)核診斷有效率可達(dá)93.33%, 表明2種方法相結(jié)合有極好的敏感性與特異性。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，各組存在差異，說明IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法聯(lián)合結(jié)核菌素試驗(yàn)優(yōu)于單純應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法檢查及結(jié)核菌素試驗(yàn)，其在附睪結(jié)核的早期診斷及鑒別診斷中有一定的臨床意義。