金釵石斛莖段誘導叢生芽的探究

鄧坦 甘婕

摘要：以金釵石斛一年生莖段組織為外植體，采用不同種類的培養基與不同配比的添加物進行了培養實驗。結果表明：以MS培養基-+-6-BA0.5mg/L+NAA 0.3rag/L+1g/L活性炭，加入10%的馬鈴薯作為天然添加物，pH值為5.8時，是金釵石斛叢生芽增殖的最佳培養基。

關鍵詞：金釵石斛;莖段;叢生芽誘導

中圖分類號：$641.1文獻標識碼：A 文章編號：1674-9944（2019）15-0102-04

1引言

金釵石斛（Dendrobium nobile LindI），屬于蘭科植物，多年生草本，其莖含有生物堿，主要為石斛堿（den-drobine）、6-羥基石斛堿（6-hydroxydendrobine）、石斛次堿（nobilonine）、多糖和多種游離氨基酸等。金釵石斛總生物堿的含量多達0.755%，多糖含量高達22.5%，屬于上品藥用石斛。研究顯示：金釵石斛含藥用成分有15種之多，性不熱、不溫、不涼，養胃、清熱解毒、止咳清肺、軟化血管等多重功效，需求量大，前景好。金釵石斛的花奇特并且鮮艷，因此具有觀賞價值。金釵石斛能進行光合作用的有效面積小，光合效率較低，生長發育速率低，對氣候條件要求非常苛刻，在自然的條件下金釵石斛需要與某些真菌互利共生才能生長，因此對于苗的栽培往往很難實現，而過去采用的分株、扦插等方式的繁殖率較低，金釵石斛的供需不平衡，當下我國將其列為中藥植物重點保護對象。目前國內主要采用快繁的方式來克服并解決各類石斛的供需問題，因此，金釵石斛的組織培養至關重要，這是實現金釵石斛大規模繁殖的途徑之一。本研究有助于探索如何快速培養金釵石斛，因此采用金釵石斛的莖段組織進行叢生芽誘導，確保金釵石斛的供應。

2材料與方法

2.1實驗材料

本次實驗材料來源于赤水金釵石斛栽培基地，通過移栽培育苗到實驗室種植，以供實驗使用。

2.2實驗設計

2.2.1第一組設計

不同植物提取液的培養基對金釵石斛莖段組織芽誘導的影響。

選取金釵石斛莖幼嫩的莖段部分，將外植體放人不同植物提取液的培養基中培養，觀察生長狀況，從中選出莖段組織芽誘導的最適培養基。

2.2.2第二組設計

不同植物提取液的培養基在加入活性炭后對金釵石斛莖段組織芽誘導的影響。

選取金釵石斛莖的幼嫩的莖段部分，將外植體放入不同的植物提取液在加入活性炭的培養基中培養，觀察其生長狀況，并對比在只加入植物提取液和加入植物提取液和活性炭的萌芽率情況，從而選出最適合金釵石斛莖段組織芽誘導的培養基。

2.2.3第三組設計

相同的植物提取液對比活性炭的有無對金釵石斛莖段組織芽誘導的影響。

選取金釵石斛莖的幼嫩的莖段部分，將外植體放入相同的植物提取液的培養基中培養，但是其中一組加入活性炭，對比在只加入植物提取液和加入植物提取液和活性炭的生長情況，從而選出最適合金釵石斛莖段組織芽誘導的培養基。

2.2.4分組實驗

將此次實驗分為三大組（表1）。

3實驗過程

3.1接種前接種室的準備

首先接種室要時刻保持干凈，接種前要對接種室進行清潔，清掃干凈每個角落，并用酒精擦拭地板，將酒精燈、濾紙、酒精棉球、75%酒精、無菌水、鑷子、手術刀等實驗試劑及實驗工具器械放入超凈工作臺。打開超凈工作臺里的紫外燈和接種室內的紫外燈進行消毒滅菌，照射2h。照射時間到后將紫外燈關閉，并打開超凈工作臺，風機適度風力吹5～6min后，即可進行實驗。

3.2外植體處理和接種

選出沒有病害且長勢好的當年生長的幼莖，將節上的葉片去掉，再置于燒杯中，用流動的自來水沖洗10min，沖洗后再放入洗潔精溶液中清洗2min，再用自來水沖洗一次，再用無菌水將其漂洗3次（使外植體的大量菌流走），最后置于干凈的燒杯接種備用。在進行實驗操作前，將雙手用酒精仔細消毒，以防止一開始就將細菌帶入超凈工作臺。在超凈工作臺上，首先將工作臺擦拭干凈，將酒精燈點燃，將濾紙擺放好，將準備好的金釵石斛的莖段組織放在濾紙上，用實驗工具將其切成大小適中的小節，長約為5cm，方便進行消毒滅菌，將切好的莖段組織放進錐形瓶中，倒入75%的酒精搖蕩處理30s，處理時間到后立即倒出酒精并及時倒入無菌水，然后反復清理潤洗2～3次，再加入準備好的0.1%升汞處理材料8min。實驗操作過程中，要來回、反復的搖動錐形瓶，保證材料能夠充分滅菌，處理時間到后將升汞倒人回收瓶，并用無菌水清洗2～3次。最后將材料取出放在濾紙上并切成帶節的小段，每段約長為1.5cm，之后接入培養基中，一瓶培養基接種一小段或兩段。為避免相互污染，接種完后對其進行編號，然后放入培養室對其進行觀察、記錄生長數據。接種過程中所用實驗工具都要進行高溫滅菌，盡量避免交叉接觸，在實驗中，操作要輕、慢，以減少污染率。

3.3培養條件

適宜的培養條件對金釵石斛的組織培養非常重要，因此我們選擇將接種好的外植體置于光照培養室中培養，培養溫度25～28℃，每天用日光燈照射12h，光照強度為2000Lx，并定期觀察莖段組織的生長情況。

4結果與分析

4.1不同植物提取液對金釵石斛莖段組織芽誘導的結果

5討論

本次實驗采用不同添加物的培養基對金釵石斛莖段組織進行叢生芽誘導，以不同的培養基對金釵石斛叢生芽的情況來選出最適合繁殖金釵石斛的方法。通過3種不同添加物對金釵石斛莖段組織的叢生芽誘導發現，經過60d的培養，可以明顯觀察到區別。通過表2我們可以得知，馬鈴薯有利于誘導芽的增殖，其中以MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L-t-10%馬鈴薯培養基最佳;在第一組實驗的基礎上，加入了活性炭進行對比，由此，通過表3可以得知MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+10%馬鈴薯在加人1g/L活性炭時為最佳;最后，單獨將5種不同的培養基進一步的進行對比，可以發現MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+10%馬鈴薯+1g/-活性炭培養基的誘導芽數最高。

適宜的培養條件及培養基對金釵石斛的莖段組織叢生芽的培養和快速繁殖十分重要，通過實驗數據我們可以清楚地發現在添加活性炭后莖段組織從生芽的數量顯著增加，這是由于活性炭吸附了莖段組織叢生芽增殖中代謝過程中的廢棄物，促進金釵石斛的形態發生和器官形成。馬鈴薯能促進莖段組織叢生芽的分化，在添加馬鈴薯的培養基中再加入活性炭，此時對于金釵石斛莖段組織叢生芽的生長效果更為顯著。金釵石斛的莖段組織在添加香蕉汁后對于叢生芽的增殖有明顯的壓制影響作用，造成這種現象很可能是因為香蕉中含有對莖段組織叢生芽誘導生長的抑制性物質，但香蕉汁能使根系生長的粗壯，對于莖段組織的叢生芽增值、分化沒有明顯的作用。

在叢生芽誘導的過程中，消毒、滅菌是一項十分重要的工作，關系到整個實驗的成敗。本次實驗的污染率比較高，其中一些污染菌類是分散在培養基中，也有一些是從材料周圍長起。污染的原因很可能是由于接種使用的實驗工具器械的滅菌不徹底、接種時瓶的開口時間太長、接種室內物品擺放雜亂、接種室紫外燈的滅菌時間太短、接種材料沒有進行徹底的滅菌、材料自帶的共生菌等原因。