核桃青皮乙醇提取液體外抑茵實驗的研究

韓曉云 劉鵬 王震 范學紅

摘要：采用平皿打孔法與生長速率法探究了核桃青皮乙醇回流提取物對3種腸道致病茵及3種霉菌性真菌的抑茵活性，為開發新型抗感染藥物提供試驗依據。結果顯示：不同濃度核桃青皮乙醇提取物對幾種供試茵均有不同程度的抑茵活性。其中對大腸桿茵0157：H7的抑茵效果好于沙門氏茵和福氏志賀茵，而對真菌的抑茵效果，則是對青霉菌效果強于根霉菌，而對葡萄孢霉菌的抑制效果較差。

關鍵詞：核桃青皮;腸道致病菌;抑茵活性

中圖分類號：$664文獻標識碼：A 文章編號：1674-9944（2019）14-0218-02

1引言

從亞歷山大·弗萊明1929年發現了青霉素，到1942年青霉素的大規模商用，抗生素的出現幫人類解決了很多問題，肺結核、炭疽等疾病都能得到治愈，所以抗生素被稱為人類的健康衛士并不為過。但隨著抗生素大量使用、濫用，也帶了很多其他問題，如耐藥菌的產生。目前耐藥菌種幾乎無處不在，極大地影響了醫治效果，對人體的健康有著無可估量的危害，因此尋找新型抗生素，脫離對現有抗生素的依賴成為改善耐藥現狀的一個途徑。

核桃青皮又稱青龍衣，為成熟核桃的外果皮。在中醫驗方中，核桃青皮可用于治療皮膚瘙癢及疼痛等病癥。現代研究也有大量的試驗表明核桃青皮具有較好的抑菌效果。商洛作為著名的核桃之鄉，核桃年產量為全國第一，同時核桃青皮作為核桃收獲中產生的農林廢棄物，有著巨大的存量。核桃青皮作為一種寶貴的可再利用資源，其抗菌藥用價值值得深入開發和利用。

目前關于核桃青皮體外抑菌試驗做的較多，但大多集中在葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等菌株，其對沙門氏菌、大腸桿菌0157：H7、福氏志賀菌等腸道致病菌的抑菌作用研究較少。本試驗主要研究核桃青皮乙醇提取液對腸道致病菌及真菌性致病菌的抑菌作用，以期為后續開發新興抗生素提供理論依據。

2材料與方法

2.1材料與儀器

2.1.1供試植物材料

核桃為商洛市洛南縣所產，自然成熟后人工剝取核桃青皮備用。

2.1.2供試菌種和試劑

大腸桿菌0157：H7、腸炎沙門氏菌、福氏志賀菌、青霉菌、葡萄孢霉菌、根霉菌、PDA培養基、MH培養基。

2.2買驗方法

2.2.1樣品干燥處理

剝去新鮮核桃青皮，采用冷凍干燥法進行處理。冷凍條件為：壓力10Pa，溫度-45℃，含水率為3.28%。待樣品充分干燥后，進行粉碎并過40目篩，備用。

2.2.2核桃青皮萃取液的制取

稱取冷凍干燥的樣品粉末10.00g，加入200mL95%乙醇溶液，65℃下回流提取8h，將提取物進行過濾后再濃縮，再將濃縮液用水定容至100mL，相當生藥含量為100mg/mL，作為實驗母液。各取母液10mL，用蒸餾水稀釋至生藥含量為100、80、60mg/mL，并依次標記為M1、M2和M3，用于抑菌實驗。

2.2.3指示茵準備

2.2.3.1細菌指示菌準備

先對細菌菌株復蘇，采用平板劃線法于37℃恒溫培養箱連續培養18h使其復蘇。再挑選單個菌落于相應液體培養基在37℃下連續培養12h進行增菌，離心收集菌體，在菌體中加入一定量的生理鹽水進行稀釋，使稀釋液OD600吸光值為0.1（細菌數量為10⁸cfu/mL），冷藏菌液備用。

2.2.3.2真菌指示菌準備

將菌株用接種環接種到PDA培養基，28℃恒溫培養7d，待出現菌斑冷藏備用。

2.2.4細菌指示茵抑茵實驗

2.2.4.1試驗平板的制備

預加菌液傾注平板法：稱取MH培養基粉末21.0g，加熱溶解于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min，待冷至50℃，將上述稀釋好的菌液1mL注人并混合均勻（試驗平板中活菌濃度約為10⁵cfu/mL），傾注培養皿水平靜置，待凝固后備用。

2.2.4.2抑菌圈直徑測定

選用平皿打孔法測定核桃青皮乙醇提取物對3種腸道致病菌的抑菌作用。將瓊脂打孔器滅菌后在試驗平皿上進行等距離打孔，分別往不同的孔中注入100uL的M1、M2、M33種不同濃度的待測核桃青皮乙醇提取液，每個待測液做3個平行試驗，測定3種濃度的待測液的抑菌效果。用等量無菌生理鹽水作陰性對照。全部注入后，將培養皿在4℃進行預擴散2h后，方放人37℃恒溫培養液持續培養24h。待培養結束，用十字交叉法測定抑菌圈直徑大小。抑菌能力的強弱由抑菌圈直徑的大小來，亦可用抑菌率來表示。抑菌率計算公式如下：

抑菌率（%）=（試驗組抑菌圈直徑一空白對照抑菌圈直徑）/試驗組抑菌圈直徑×100%。

2.2.5真菌指示菌抑菌試驗

2.2.5.1試驗平板的制備

稱取46g的PDA培養基于1000mL無菌水中，熔化后滅菌，待培養基冷卻至50℃左右，將其倒入培養皿等待冷卻凝固備用。

2.2.5.2抑菌直徑測定

采用生長速率法來測定提取物的抑菌活性。用移液槍取100uL的M1、M2、M33種不同濃度的待測核桃青皮乙醇提取液和對照液注入不同的PDA培養皿中，用一次性涂布棒涂抹，使其待測液與對照液均勻分布于平板。用滅菌瓊脂打孔器取3mm菌片，小心移到涂有待測液的PDA平板上，每個處理做3個平行試驗，完成后將各平皿放人28℃恒溫培養箱中培養72h，測定抑菌圈直徑。試驗過程中要無菌操作，并做好標記。

真菌菌落直徑=測量直徑平均值-3mm。

抑菌率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。

3結果與分析

3.1核桃青皮乙醇提取液對3種腸道致病菌的抑菌效果

核桃青皮中存在著豐富的抑菌或殺菌活性物質，95%乙醇回流提取的不同濃度核桃青皮提取液均對3種供試腸道致病菌有一定的抑菌效果，結果見表1。提取物濃度不同，對3種細菌的抑菌作用也不同，對相同的供試菌，抑菌圈直徑M1>M2>M3，這表明濃度高低與抑菌圈直徑大小呈正相關性，即抑菌效果呈現劑量依賴效應。在3種供試菌中，對大腸桿菌0157：H7的抑菌效果最好，其次是腸炎沙門氏菌與福氏志賀菌。其中濃度為100mg/mL的M1提取物對大腸桿菌的抑菌圈直徑達到了16.3mm，抑菌率高達81.6%。陰性對照組無菌水及95%乙醇對照試驗均無抑菌效果。

3.2核桃青皮乙醇提取液對霉菌性真菌的抑茵效果

不同濃度核桃青皮乙醇提取液對霉菌性真菌的抑菌效果如表2所示，95%乙醇回流提取的不同濃度核桃青皮提取液對3種供試霉菌性真菌的抑菌圈直徑不盡相同，表明提取物對不同的霉菌性菌株的抑菌效果具有差異性，抑菌作用從大到小依次為青霉菌>根霉菌>葡萄孢霉菌，對青霉菌的抑制效果最明顯，對葡萄孢霉菌的抑制效果最差。對同一種供試霉菌的抑菌效果，提取物的濃度不同，抑茵效果也表現出了差異，濃度越大，抑菌效果越好，這提示提取物濃度與抑菌率呈正相關性，即抑菌效果呈現劑量依賴效應。其中濃度為100mg/mL的提取液對青霉菌抑菌率高達79.1%。陰性對照組中無菌水及95%乙醇對3種供試霉菌均無抑菌效果。

4討論

現代科學研究表明核桃青皮中含有很多活性物質。目前從核桃青皮中分離出很多成分都具有一定的抑菌活性，如胡桃醌、胡桃素、4，8一二羥基-1-四氫萘酮、β-谷甾醇、蘆丁、槲皮素、山萘酚等。張衛星等人。研究核桃青皮不同極性試劑提取物對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、青霉菌、白色念珠菌等細菌和真菌的抑菌作用，結果表明各提取物均有不同程度的抑菌效果。王剛霞等人研究核桃青皮乙醇提取物對幾種采后病原真菌抑制作用，結果表明提取物對供試菌均有明顯的抑制效果。曹文利等人研究核桃青皮醇提物及堿提物對對鏈格孢菌的抑菌活性，結果表明核桃青皮醇提物在抗氧化和抑菌方面都有良好的效果。本研究也證實了核桃青皮乙醇提取物的抑菌效果，其對3種腸道致病菌及3種霉菌性真菌的生長繁殖均有一定的阻礙作用，但是由于各方面原因，關于核桃青皮乙醇提取物的抑菌機靼本實驗未有涉及。許紫峻等人探究核桃青皮乙醇提取物抑制霉菌的作用機理，結果表明提取物主要通過增加菌體細胞膜通透性或破壞細胞膜使其破裂來抑制菌體的生長繁殖。任先偉等人研究核桃青皮各萃取相對金黃色葡萄球菌等7種細菌的抑菌作用及抑菌機理，結果表明各萃取相均有抑菌作用，且主要是通過損害菌體細胞膜通透性、細胞壁及細胞內容物來發揮抑菌作用。后期將繼續深入探究核桃青皮乙醇提取物的抑菌機理。另外關于提取物是否對人體細胞和植物細胞有毒性，也需要進行深入探索與研究。

5結語

核桃青皮乙醇提取物對3種腸道致病菌及3種供試菌均有抑菌活性，其中對大腸桿菌和青霉菌的抑菌效果最好，而對福氏志賀菌及葡萄孢霉菌的抑菌效果相對較差。隨后進一步從DNA及細胞結構角度深入探索核桃青皮的抑菌作用機理，以及其對人體細胞及植物細胞是否有毒性，以期為開發新型抗生素治療臨床腸道感染性疾病奠定理論基礎，為對開發新型植物源性殺菌劑提供一種選擇。