長鏈非編碼RNA調控間充質干細胞成軟骨分化的研究進展

姚楠 李聰聰 宋敏 許學猛 劉文剛 陳國材 陳國茜 葉國柱

[摘要] 修復骨關節炎（OA）引起的關節軟骨損傷一直是關節外科的熱點與難點。近年來間充質干細胞成為了軟骨修復和細胞治療方面受人關注的細胞。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是指一類轉錄本長度超過200 nt、不編碼蛋白質的RNA。最近的研究表明，lncRNA在間充質干細胞成軟骨分化過程中呈現出明顯的差異表達，并且在間充質干細胞成軟骨分化過程中發揮著重要的調控作用。本文綜述了lncRNA DANCR、lncRNA HOTAIRM1-1、lncRNA ROCR、lncRNA ZBED3-AS1和lncRNA HIT調控間充質干細胞成軟骨分化的研究，并探討了當前研究存在的問題，以期將來為OA的細胞治療提供參考。

[關鍵詞] 長鏈非編碼RNA;間充質干細胞;分化;軟骨細胞

[中圖分類號] R329.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）09（c）-0033-04

Research progress on regulation of long non-coding RNA in differentiation of mesenchymal stem cells into chondrocytes

YAO Nan1? ?LI Congcong2? ?SONG Min2? ?XU Xuemeng3? ?LIU Wengang3? ?CHEN Guocai2? ?CHEN Guoqian2? ?YE Guozhu2

1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Research and Development in Traditional Chinese Medicine， Guangdong Province Engineering Technology Research Institute of Traditional Chinese Medicine， Guangdong Province， Guangzhou? ?510095， China; 2.the Fifth Clinical Medical College， Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangdong Province， Guangzhou? ?510095， China; 3.Department of Orthopedics， Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital， Guangdong Province， Guangzhou? ?510095， China

[Abstract] Repair of articular cartilage injury caused by osteoarthritis （OA） has always been a hotspot and difficult point in joint surgery. Mesenchymal stem cells have become the focus of cartilage repair and cell therapy in recent years. Long non-coding RNA （lncRNA） refers to a class of RNA whose transcript length exceeds 200 nt and does not code for proteins. Recent studies have shown that lncRNA is significantly differentially expressed during the differentiation of mesenchymal stem cells into chondrocytes and plays an important role in the process of the differentiation of mesenchymal stem cells into chondrocytes. This paper reviews the research on regulation of lncRNA DANCR， lncRNA HOTAIRM1-1， lncRNA ROCR， lncRNA ZBED3-AS1 and lncRNA HIT in differentiation of mesenchymal stem cells into chondrocytes， and discusses the existing problems in current studies， in order to provide references for the future cell therapy of OA.

[Key words] Long non-coding RNA; Mesenchymal stem cells; Differentiation; Chondrocyte

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種中老年人常見的退行性疾病，其重要特征是關節軟骨的退變和損傷。由于缺乏神經分布和血管供應，關節軟骨一旦受損則很難自我修復[1]。因此關節軟骨損傷修復一直是關節外科研究的熱點與難點。間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）是來源于中胚層的多能干細胞，具有自我更新和多向分化的潛能[2]，在一定條件下可以定向分化成軟骨細胞，并在關節軟骨修復中發揮重要的作用[3]。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類轉錄本長度超過200 nt、不編碼蛋白質的RNA，長期以來被認為是基因組中的“暗物質”。近年來的研究發現lncRNA可參與多種干細胞分化和機體發育過程，并與RNA、增強子和修飾染色質的蛋白質復合物產生復雜的相互作用網絡[4]，從而影響機體的生命活動以及疾病的發生和發展。最新的研究表明，lncRNA在調控MSC成軟骨分化過程中發揮著重要的調控作用，可能是關鍵的調控位點[5-6]。

1 MSC向軟骨分化的潛能

MSC最早由Friedenstein等[7]于1974年在骨髓中發現，后來研究表明MSC存在于臍帶、臍血、脂肪及胎盤等多種組織中，具有很強的自我更新和多向分化潛能，在處于適宜的體內或體外誘導環境下可以分化為軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞、骨骼肌細胞和神經細胞等。目前，動物實驗和臨床試驗均有應用MSC修復軟骨損傷的報道。Zhang等[8]將兔脂肪來源的MSC接種在聚L-谷氨酸和殼聚糖交聯制備的三維多孔支架材料上，發現MSC在這種支架材料內可自發地形成細胞聚團，而且這些細胞聚團在支架內部能夠有效地進行成軟骨分化，并在動物模型中成功修復了軟骨損傷。Jo等[9]評估了關節內注射自體脂肪組織來源的MSC治療OA的安全性和有效性，發現膝關節注射MSC的OA患者在注射6個月后沒有出現不良反應，并且高劑量組患者膝關節軟骨缺損部位有透明樣的軟骨出現。Vega等[10]將異體骨髓來源的MSC注射入OA患者的膝關節腔，并與注射透明質酸的患者比較，術后跟蹤患者的疼痛、殘疾以及生活質量狀況達1年，核磁共振成像表明注射MSC的患者軟骨缺損得到了更好的修復。Kim等[11-12]的臨床研究發現膝關節部位的MSC注射和植入均能有助于修復OA患者膝關節的軟骨損傷，并且采用MSC植入的方式比注射效果更好。Pleumeekers等[13]研究發現人脂肪組織和骨髓來源的MSC可以替代80%的軟骨細胞而不影響軟骨基質的產生及穩定性。總體來說，目前基于MSC的細胞療法應用于臨床軟骨損傷修復治療的病例較少，深入探討MSC成軟骨分化的機制將有助于臨床OA細胞療法的完善和優化。

2 lncRNA調控MSC成軟骨分化

lncRNA是最近公認的一類非編碼RNA，是RNA聚合酶Ⅱ的轉錄產物，其占到非編碼RNA的80%以上，但卻是目前研究及了解最少的一類RNA。最新的人類基因組注釋（第20版，GRCh38）鑒定了來自14 470個lncRNA基因的24 489個lncRNA轉錄本[5]。根據它們在基因組中的位置可以分為正義lncRNA、反義lncRNA、雙向lncRNA、基因內lncRNA和基因間lncRNA等[14-15]。Wang等[16]首次使用lncRNA芯片檢測了lncRNA在人骨髓MSC成軟骨分化過程中的表達，結果發現有3638個lncRNA出現明顯的差異表達（倍數變化>2.0或<-2.0，P < 0.05），其中2166個lncRNA表達上調，1472個lncRNA表達下調。這些差異表達的lncRNA可能參與調控了MSC向軟骨分化，值得深入研究。近年來，關于MSC成軟骨分化過程中lncRNA的研究還很少，目前主要有關于lncRNA DANCR、lncRNA HOTAIRM1-1、lncRNA ROCR、lncRNA ZBED3-AS1和lncRNA HIT等的研究。

2.1 lncRNA DANCR調控MSC成軟骨分化

lncRNA DANCR是一種最早在表皮細胞中被發現的高表達lncRNA，它維持表皮細胞處于未分化狀態[17]。研究發現lncRNA DANCR可以調控CTNNB1基因的表達進而引起CTNNB1基因下游通路如Wnt通路的改變[18]。由于Sox4促進滑膜MSC增殖和軟骨形成，而Sox4可以直接與lncRNA DANCR的啟動子結合并增加其表達，因此調控Wnt通路可能是Sox4誘導lncRNA DANCR進而促進滑膜MSC增殖和成軟骨分化的一種機制[19]。深入研究表明lncRNA DANCR直接與myc、Smad3和STAT3 mRNA相互作用以調控它們的穩定性，并且lncRNA DANCR誘導滑膜MSC增殖依賴于myc，促進滑膜MSC成軟骨分化與上調Smad3和STAT3表達有關[20]。另外，通過miRNA芯片檢測發現過表達lncRNA DANCR的滑膜MSC中miR-1305出現明顯的下降。miR-1305過表達抑制了lncRNA DANCR誘導的滑膜MSC增殖和成軟骨分化，這表明miR-1305拮抗了lncRNA DANCR的功能。進一步研究發現TGF-β信號通路中的Smad4是miR-1305調控的下游靶基因，而Smad4有助于lncRNA DANCR發揮促進滑膜MSC增殖和成軟骨分化的作用。總之，研究表明調控miR-1305-Smad4軸是lncRNA DANCR促進滑膜MSC成軟骨分化的另一種機制[21]。值得一提的是，研究還發現lncRNA DANCR在OA軟骨組織中表達明顯升高，并且可以充當miR-216a-5p的競爭性內源RNA。lncRNA DANCR可以通過調控miR-216a-5p/JAK2/STAT3信號通路促進OA軟骨細胞的增殖，抑制細胞凋亡[22]。綜上所述，lncRNA DANCR不僅是調控MSC成軟骨分化的重要物質，也是直接干預軟骨細胞生物學功能的重要物質，有望成為臨床治療OA的一個突破點[23]。

2.2 lncRNA HOTAIRM1-1調控MSC成軟骨分化

Xiao等[24]在OA軟骨樣本中發現lncRNA HOTAIRM1-1表達明顯降低，而miR-125b表達明顯升高;lncRNA HOTAIRM1-1表達在誘導MSC成軟骨分化后4 d升高，并在8 d后進一步升高，而miR-125b具有相反的表達變化。這些結果表明兩者存在反向的表達。抑制lncRNA HOTAIRM1-1表達可以抑制MSC增殖，誘導MSC凋亡并且抑制MSC軟骨分化。此外，lncRNA HOTAIRM1-1負調控miR-125b的表達，而miR-125b通過靶向骨形態發生蛋白受體2（bone morphogenetic protein receptor 2，BMPR2）調控MSC增殖、凋亡和軟骨分化。最終結果表明lncRNA HOTAIRM1-1表達下調可能是通過調控miR-125b/BMPR2軸抑制MSC增殖、誘導凋亡和抑制軟骨分化，并且其可能激活JNK/MAPK/ERK信號通路從而促進OA的發展[24]。以上研究表明lncRNA HOTAIRM1-1是OA發病以及細胞療法中一個值得關注的新靶點。

2.3 lncRNA ROCR調控MSC成軟骨分化

Barter等[25]通過lncRNA測序，從股骨頸骨折患者髖關節軟骨中獲得了許多lncRNA的轉錄本。其中一種調節軟骨分化的RNA即lncRNA LOC102723505，也被稱為lncRNA ROCR。已有研究表明Sox9是一種可以調控軟骨分化的轉錄因子[26]。在MSC成軟骨分化過程中，lncRNA ROCR和Sox9表達均顯著升高。當抑制lncRNA ROCR表達后，Sox9、Col2a1和Acan表達水平明顯降低，因而推測出lncRNA ROCR可能位于Sox9上游發揮調控作用[25]。總之，提高lncRNA ROCR表達有助于MSC的Sox9表達和軟骨分化，將來可能在軟骨損傷細胞療法中發揮作用。

2.4 lncRNA ZBED3-AS1調控MSC成軟骨分化

基于人骨髓MSC成軟骨分化的lncRNA芯片研究結果發現，lncRNA ZBED3-AS1在誘導分化7 d時表達顯著升高，在14 d時達到頂峰，并一直持續到28 d，表明其是骨髓MSC成軟骨分化過程中表達量最高的lncRNA之一，在早期軟骨分化中起著關鍵的調控作用[16]。Ou等[27]進一步研究發現lncRNA ZBED3-AS1在人滑膜液MSC中的過表達可通過上調zbed3表達，進而激活參與軟骨形成的Wnt/β-catenin信號通路來增強軟骨分化的潛能。并且Wnt通路抑制劑DKK1可以逆轉lncRNA ZBED3-AS1對軟骨形成的促進作用。因而，由于lncRNA ZBED3-AS1在人滑膜液MSC成軟骨分化中發揮了調控作用，其可能有助于OA的治療。

2.5 lncRNA HIT調控MSC成軟骨分化

除了以上關于成體組織MSC成軟骨分化研究外，在E11小鼠胚胎未分化的四肢MSC中發現lncRNA HIT存在高表達，定位于細胞核內，并且形成lncRNA-HIT-p100/CBP復合體。運用siRNA干預LncRNA HIT表達會減少四肢MSC凝聚，抑制四肢MSC的軟骨形成。深入研究表明lncRNA HIT siRNA的干預通過降低H3K27ac或p100活性影響了促軟骨形成相關基因的表達，最終抑制了復合體對軟骨形成的促進作用[28]。因此，這些研究結果表明lncRNA HIT在四肢成軟骨分化過程中發揮著重要作用。

3 討論

目前運用MSC進行細胞治療干預OA軟骨損傷和修復成為了熱點。lncRNA是廣泛存在于哺乳動物細胞中的一類非編碼RNA，近年來人們陸續發現了其在各種疾病的發生發展過程中均扮演了重要角色，并且還發現lncRNA在調控MSC成軟骨分化過程中發揮著重要作用。然而，盡管當前lncRNA芯片技術已篩選出MSC成軟骨分化過程中大量明顯差異表達的lncRNA，但只有其中一小部分lncRNA被研究了，并且相關研究還不夠深入和全面。總體來說，現階段對于lncRNA調控MSC成軟骨分化的研究還處在初級階段。未來的相關研究應該充分運用lncRNA芯片、lncRNA測序以及生物信息學等新技術和新方法，從編碼RNA即mRNA、非編碼RNA如miRNA和circRNA等、蛋白及信號通路等水平上對lncRNA進行深入研究，找到目標lncRNA所參與的分子生物調控網絡，這樣才能對其有準確的認識[29]。另外，考慮到單一lncRNA的調控作用有限，有必要考慮組合運用lncRNA來發揮調控作用[30]。總之，研究lncRNA調控MSC成軟骨分化在關節軟骨損傷修復中具有重大意義，對lncRNA的深入研究有望推進臨床OA細胞療法的廣泛應用。

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（收稿日期：2019-05-06? 本文編輯：張瑜杰）