前列腺癌組織中VEGF-C、Bcl-xl 的mRNA 表達及與臨床病理特征及預后的關系

韓躍輔 陳 東 彭 斂 黃洪才

廣東省粵北人民醫院泌尿外科一區，廣東韶關 512026

全球范圍內，前列腺癌（PCa）是老年男性常見惡性腫瘤。2012 年全球男性PCa 的發病率在所有惡性腫瘤中居第二位[1-2]。PCa 是激素依賴性的惡性腫瘤，經雄激素剝奪治療一段時間后出現雄激素抵抗的現象，形成去勢抵抗PCa，可發生遠處轉移，導致患者不良的生存預后[3]。因此深入研究PCa 的病因及其發生發展機制，對于早期診斷及尋找有效的治療靶點具有重要意義。血管內皮生長因子C（VEGF-C）位于人類染色體4q34.3，該基因編碼的VEGF-C 蛋白質是血小板衍生生長因子/VEGF 家族的成員，VEGF-C 的蛋白前體經過裂解加工后，可結合并激活VEGF 受體2，促進淋巴管生成與淋巴內皮細胞生長[4-5]。B 細胞淋巴瘤/白血病-xl（Bcl-xl）基因編碼的蛋白是B 細胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）家族的抗凋亡蛋白。研究[6-7]表明，細胞外的整合素信號活化可通過活化核因子κB（NFκB）通路與Bcl-xl 增強促炎性趨化因子8（CXCL8）的分泌，參與促進腫瘤的惡性進展過程。本研究通過檢測PCa 組織中VEGF-C、Bcl-xl 的表達，研究兩者間的關系及與臨床病理特征的關系，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014 年1 月～2016 年6 月就診于廣東省粵北人民醫院（以下簡稱“我院”）的132 例PCa 患者的臨床病理資料作為研究對象。納入標準：①所有PCa患者均經穿刺活檢病理或術后病理檢查確診；②臨床病理及隨訪資料完整；③患者一般狀況良好，Karnofsky功能狀態評分（KPS 評分）≥80 分。排除標準：①合并急慢性前列腺炎、泌尿生殖系感染、呼吸道感染等疾病者；②合并其他器官系統的惡性腫瘤者；③合并心肝腎等重要臟器功能不全者；④患者近3 月有心腦血管疾病病史者；⑤既往接受過內分泌、放射治療等抗腫瘤治療者。年齡50～75 歲，平均（61.8±7.2）歲。PCa 病理分級根據Gleason 評分系統具體分為Gleason 評分≤6 分61 例，Gleason 評分≥7 分71 例。腫瘤TNM分期參照《中國泌尿外科疾病診斷治療指南》[8]中推薦的標準，Ⅰ～Ⅱ期82 例，Ⅲ～Ⅳ期50 例。患者入院后初始血清前列腺特異性抗原（PSA）：8.1～190.0 ng/mL，中位PSA 為44.6 ng/mL，其中≤20.0 ng/mL 39 例，＞20.0 ng/mL 93 例。伴有遠處轉移31 例，不伴遠處轉移101 例。所有PCa 患者的治療方案選擇參照《中國泌尿外科疾病診斷治療指南》[8]中首選的治療方案（推薦分級A）。選取我院同期手術治療的40 例良性前列腺增生（BPH）患者作為研究對象。年齡52～77 歲，平均（63.5±6.9）歲。BPH 患者為初次診斷，未接受過藥物、手術等其他治療，并排除其他惡性腫瘤。所有PCa患者均予以隨訪，自出院之日起開始隨訪，隨訪期間無失訪病例，隨訪時間2～48 個月，中位隨訪時間35.1 個月，采用門診復查或電話方式進行隨訪，隨訪內容包括患者生存狀況等，隨訪終點為隨訪時間的結束或患者死亡，隨訪截至2019 年6 月。本研究經我院醫學倫理委員會批準通過，所有患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 組織中VEGF-C mRNA 和Bcl-xl mRNA 表達檢測

采用實時定量PCR（qRT-PCR）法檢測組織中VEGF-C mRNA 和Bcl-xl mRNA 的表達。收集術中獲取的新鮮PCa 組織及BPH 組織，液氮速凍后轉運至實驗室，置于-80℃冰箱保存。取約100 mg 的組織，研缽研磨后應用Trizol 法提取總RNA，紫外分光光度計鑒定提取RNA 的濃度和純度。以2 μg 總RNA 為模板，用TaqMan 逆轉錄試劑盒（美國應用生物系統公司，生產批號：20130726）進行逆轉錄合成cDNA，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。VEGF-C 引物正向序列：5′-GAGGAGCAGTTACGGTCTGTG-3′，反向引物序列：5′-TCCTTTCCTTAGCTGACACTTGT-3′；Bclxl 引物正向序列：5′-G-GAGAGCGTTCAGTGATC-3′，反向引物序列：5′-GG-AGAGCGTTCAGTGATC-3′；內參基因GAPDH 上游序列：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游序列：3′-GCCATCACGCCACAGTTTC-5′。PCR 總反應體系為20 μL，包括2 μL 的模板cDNA，上游及下游引物各1 μL，Power SYBR Green Master Mix 試劑12.5 μL、ddH2O 補足體系至3.5 μL。反應條件為：95℃預變性5 min，95℃變性10 s、60℃退火/延伸45 s，變性和退火/延伸步驟共40 個循環。每個樣本重復3 次，最終結果取平均值。最終結果應用2-ΔCt值表示，目的基因VEGF-C、Bcl-xl 的相對表達水平的計算公式為：ΔCt=CtVEGF-C/Bcl-xl-CtGAPDH。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件對所得數據進行分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗。Pearson 線性相關分析VEGF-C mRNA 和Bcl-xl mRNA 表達之間的相關性。Kaplan-Meier 生存分析探究不同VEGF-C、Bcl-xl 表達患者生存預后差異。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCa 和BPH 組織中VEGF-C mRNA 和Bcl-xl mRNA 的表達比較

PCa 組織VEGF-C mRNA 的相對表達量（12.64±1.53）明顯高于BPH 組織（7.67±1.21），差異有統計學意義（t=18.825，P=0.000）；PCa 組織Bcl-xl mRNA 的相對表達量（1.52±0.40）明顯高于BPH 組織（0.74±0.22），差異有統計學意義（t=11.788，P=0.000）。Pearson 線性相關分析結果示，PCa 組織中VEGF-C mRNA 與Bcl-xl mRNA 的表達呈正相關（r=0.637，P=0.008）。

2.2 PCa 組織VEGF-C mRNA、Bcl-xl mRNA 表達與臨床病理特征的關系

不同年齡、Gleason 評分、入院PSA 的患者PCa組織中VEGF-C mRNA、Bcl-xl mRNA 表達比較，差異均無統計學意義（均P ＞0.05）。不同TNM 分期及是否存在遠處轉移的患者PCa 組織中VEGF-C mRNA、Bcl-xl mRNA 表達比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。Ⅲ～Ⅳ期、有遠處轉移PCa 組織中VEGF-C mRNA、Bcl-xl mRNA 表達明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、無遠處轉移者。見表1。

表1 患者臨床病理特征的關系與癌組織中VEGF-C mRNA、Bcl-xl mRNA 表達（）

表1 患者臨床病理特征的關系與癌組織中VEGF-C mRNA、Bcl-xl mRNA 表達（）

注：VEGF-C：血管內皮生長因子C；Bcl-xl：B細胞淋巴瘤/白血病-xl；PSA：前列腺特異性抗原

2.3 VEGF-C mRNA、Bcl-xl mRNA 的表達與PCa患者預后關系

以VEGF-C mRNA 的均值12.64 為界，分為高VEGF-C mRNA 組（63 例）和低VEGF-C mRNA 組（69 例），兩組3 年總體生存率（OS）比較，高VEGF-C mRNA 組3 年OS（57.1%）明顯低于低VEGF-C mRNA 組（88.4%），差異有統計學意義（χ2=9.134，P=0.000）。以Bcl-xl mRNA 均值1.52 為界，分為高Bcl-xl mRNA組（65 例）和 低Bcl-xl mRNA 組（67 例），高Bcl-xl mRNA 組3 年OS（58.4%）明顯低于低Bcl-xl mRNA組（88.1%），差異有統計學意義（χ2=8.875，P=0.003）。見圖1。

3 討論

PCa 是男性中排第二位的常見的惡性腫瘤。目前研究已表明年齡、種族、遺傳和職業等因素均能夠影響PCa 疾病的發生和發展[9]。VEGF-C 在結合并激活血管內皮細胞及腫瘤細胞表面VEGFR-2 和VEGFR-3受體后，可促進血管生成和腫瘤細胞的增殖，并有利于腫瘤細胞的血行轉移[10-11]。本研究中，PCa 組織中VEGF-C mRNA 表達明顯高于BPH 組織。其原因是正常狀態時上皮細胞膜蛋白-1（EMP-1）能夠抑制半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶和VEGF-C 蛋白的表達，對細胞增殖發揮抑制負性調控作用，而PCa 組織中EMP-1 表達降低，抑制作用減弱，導致VEGF-C蛋白表達水平升高[12-13]。本研究中，不同TNM 分期及是否存在遠處轉移的的患者PCa 組織中VEGF-C mRNA 表達比較，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。其原因是腫瘤組織中VEGF-C mRNA 表達增加能夠促進趨化因子受體7（CCR7）的表達增加和活化，促進腫瘤細胞增殖，使腫瘤分期增高，而在干擾RNA轉染的PCa 細胞中敲低CCR7 的表達后，VEGF-C誘導PCa 細胞增殖、遷移和侵襲能力顯著被抑制[14]。此外，伴有遠處轉移患者癌組織中VEGF-C mRNA 的表達較高，其機制是腫瘤微環境中VEGF-C mRNA 的表達增加后，通過旁分泌作用與血管內皮細胞及淋巴管內皮細胞，促進血管淋巴管的生成，并且由于新生血管基底膜不完整，腫瘤細胞易侵襲浸潤至血管腔內，進而向遠處轉移灶轉移[15]。本研究中高VEGF-C mRNA 表達患者3 年OS 明顯較低，提示PCa 組織中VEGF-C mRNA 的表達有可能成為新的提示PCa 預后的分子標志。

圖1 不同VEGF-C mRNA、Bcl-xl mRNA 表達水平與PCa 患者預后的關系

Bcl-xL 是Bcl-2 蛋白家族成員，當DNA 損傷或大量蛋白質聚集時，凋亡信號傳導通路激活，含BH3結構域的蛋白質如p53 激活細胞凋亡調節因子（PUMA），促凋亡蛋白從Bcl-xL 的結合中釋放，導致下游凋亡級聯反應的啟動[16]。抗凋亡蛋白在多種不同的實體腫瘤中過表達，可促進腫瘤細胞的增殖、抑制其凋亡，并參與腫瘤的耐藥過程[17]。本研究中，PCa 組織中Bcl-xL mRNA 表達上調。其機制可能是調控其表達的長鏈非編碼RNA-HEIH 表達升高后，競爭性結合并抑制mir-939 的表達，導致mir-939 對Bcl-xL表達抑制作用減弱[18]。本研究中，不同TNM 分期及是否存在遠處轉移的的患者PCa 組織中Bcl-xl mRNA表達比較，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。其原因除腫瘤細胞凋亡減少外，Bcl-xL 還具有促進腫瘤發展的作用[19]。此外，Bcl-xL mRNA 高表達患者生存預后較差，表明Bcl-xL mRNA 亦可能成為PCa 預后的分子標志。本研究中，PCa 組織中VEGF-C mRNA 與Bcl-xL mRNA 表達呈正相關，可能是VEGF-C mRNA表達升高后結合細胞表面的VEGFR2，進而激活細胞內PI3K-Akt 信號通路的傳導，蛋白激酶B（PKB）磷酸化Bcl-2 相關的細胞死亡激動劑（Bad）后，Bad 對Bcl-xL 表達的抑制作用降低。有報道[20]稱靶向Y-盒結合蛋白1 的反義寡核苷酸能通過下調Bcl-xLVEGFR2 軸，發揮抑制腫瘤血管生成作用，證實VEGFC 與Bcl-xL 在腫瘤發生及血管生成過程中可能存在協同作用。

綜上所述，PCa 組織中VEGF-C mRNA 與Bcl-xL mRNA 均表達升高，兩者與PCa 的腫瘤TNM 分期、是否伴有遠處轉移有關，可能均參與促進PCa 的發展過程，但兩者的相互作用機制及臨床意義尚需要進一步研究。