凡納濱對蝦低溫差異表達miRNA的分析鑒定及靶基因的驗證

卓曉菲 何蘋萍 韋嬪媛 陳曉漢 彭金霞

(1. 廣西大學動物科學技術學院, 南寧 530004; 2. 廣西壯族自治區水產科學研究院, 廣西水產遺傳育種與健康養殖重點實驗室, 南寧 530021)

凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)是世界上養殖最廣泛的對蝦種類之一。在養殖對蝦時, 不同的環境脅迫因子, 包括鹽度、pH和溫度的變化, 會導致其生長和存活率降低, 增加疾病的易感性, 甚至導致死亡[1,2]。凡納濱對蝦起源于熱帶, 后被推廣至亞熱帶地區養殖, 低溫對其生存及生長造成極大的影響[3]。目前關于南美白對蝦應對低溫反應分子機制的研究很少, 僅僅有運用SSH[3]和蛋白質組學[4]分析南美白對蝦低溫反應分子機制的研究。

小RNA是能夠調節蛋白質表達的短的非編碼RNA。這些核苷酸可以全部或部分互補結合到mRNA的3′非翻譯區(UTR), 這將抑制靶基因的翻譯。眾所周知, miRNAs在調節許多真核細胞的過程中有重要的作用, 包括細胞分化、增殖、凋亡、能量代謝、癌癥的發展以及免疫防御等方面有重要的作用[5]。自從2001年首次發現miRNA以來, 許多研究人員已經證明, 在許多物種中, miRNA在不同的環境脅迫下表現出差異表達。研究已證實,miR-1-3p、miR-14、mir-31a-3p和miR-284-3p在昆蟲低溫適應過程中參與調控[6]; tsc-miR-20a和tscmiR-21在龜的低溫脅迫過程中參與調控[5]。已有的水生生物應對低溫脅迫的miRNA表達研究包括斑馬魚腦組織在低溫脅迫下的差異miRNA表達等[7]。然而, 針對凡納濱對蝦的低溫適應miRNAs及靶基因的研究仍然十分匱乏。到目前為止, 對凡納濱對蝦miRNA的研究主要集中在免疫防御方面, 如感染白斑綜合征病毒后miRNA的表達變化[8]。由于肝胰腺是參與凡納濱對蝦免疫、造血、代謝、解毒的重要器官, 故選擇其進行分析[9]。并且已有研究證明, 在低溫脅迫之后, 低溫反應基因在凡納濱對蝦肝胰腺中有較高的表達水平[3]。因此我們利用Solexa對凡納濱對蝦在常溫(28℃)及低溫鍛煉(16℃, 6d)下的肝胰腺小RNA進行測序, 并運用qRT-PCR驗證差異顯著的miRNAs以及靶基因的表達模式, 以期能初步解析miRNAs在凡納濱對蝦低溫適應過程中的分子調控機制。

1 材料與方法

1.1 低溫脅迫實驗及樣品采集

從防城港水產養殖基地獲得凡納濱對蝦數10只(3個月大, 體重10—15 g), 在廣西水產科學研究院水族館飼養, 并在實驗前一周讓其適應28℃水溫, 30%—35%鹽度的條件。實驗組以每2小時1℃的速度降溫, 直至16℃。實驗組在16℃水溫維持6d,在低溫到達0、24h、72h和144h的時候分別采集對蝦肝胰腺樣本。對照組水溫維持在28℃, 并且和實驗組(16℃)在同樣的時間點進行采樣。采集的樣品立即保存在液氮或RNA保護液(上海捷瑞)中, 后轉移至-80℃超低溫冰箱。

1.2 小RNA測序文庫的構建及測序

常溫、低溫處理每個取樣點選擇3尾蝦, 分別用Trizol reagent (Invitrogen)提取肝胰腺的總RNA,等量混合后, 電泳分離16—30 nt的小分子 RNA, 進行Solexa高通量測序。小RNA 文庫的Solexa測序由北京諾禾致源生物公司完成。

1.3 生物信息學分析

在測序完成后, 首先去除接頭序列及低質量序列, 用bowtie將長度篩選后的sRNA 定位到凡納濱對蝦的轉錄組參考序列上, 然后將上述mapped到參考序列上的reads, 與Rfam database (11.0, http://Rfam.sanger.ac.uk/)數據庫進行比對, 除去snRNA、snoRNA、rRNA、tRNA和重復序列, 剩下的序列在miRBase (version18.0, http://www.mirbase.org/)中進行比對, 完全匹配的為已知的成熟miRNA序列。進一步運用miREvo[10]和mirdeep2[11]軟件來預測新的miRNA (novel miRNAs)。

1.4 顯著差異miRNA的表達分析

在進行差異miRNA 表達分析時, 對各樣本中已知和新的miRNA進行表達量的統計, 用TPM進行表達量歸一化處理。使用DEGseq (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DEG-seq.html)對常溫及低溫組的miRNAs進行差異表達分析。為進一步驗證獲得的差異顯著miRNAs的表達規律, 采用莖環RT-qPCR對凡納濱對蝦在常溫及不同低溫鍛煉條件下的肝胰腺進行了相對表達量的檢測分析, 常溫下肝胰腺的表達量被設定為1。每個實驗組有3只蝦的肝胰腺作為生物學重復。莖環RT-qPCR所使用的引物如表 1所示。

表1 RT-qPCR驗證差異表達miRNAs使用的引物序列Tab. 1 Primer sequences used for RT-qPCR

1.5 miRNA靶基因的表達分析

為了進一步闡明差異表達miRNAs的生物學過程和生理功能, 對差異表達的miRNAs進行靶基因預測, 再根據miRNA與其靶基因間的對應關系, 對每組差異表達miRNA的靶基因的集合分別進行Gene Ontology(GO)和KEGG富集分析。將預測出的低溫差異表達miRNAs的靶基因與課題組前期低溫轉錄組分析獲得的低溫顯著差異表達基因進行比對, 從二者重合的基因集中挑選出4個基因, 即nuclear export mediator factor Nemf-lik、synapse-associated protein、seleno proteins 以及DEAD-box RNA helicase Variant 1, 運用qRT-PCR驗證其在低溫不同時間點的表達規律。

2 結果

2.1 肝胰腺中獲得的miRNAs的基本特征

分別從常溫組和低溫組對蝦的肝胰腺小RNA文庫中獲得14754823和14945246條原始序列。去除低質量序列、接頭序列和短序列后, 分別篩選出18—32 nt的10690259和8587144條高質量序列進行進一步的分析。

2.2 已知miRNAs的鑒定

用bowtie將長度篩選后的sRNA 定位到凡納濱對蝦轉錄組參考序列上, 將定位成功的序列與Rfam database 數據庫進行比對, 除去tRNAs、rRNAs、snRNA或noRNAs和重復序列, 從常溫和低溫組對蝦肝胰腺小RNA文庫中分別獲得892001條與858237條miRNAs。再將獲得的miRNAs序列在miRBase中進行比對, 常溫和低溫組分別鑒定出57及48條已知的成熟miRNAs。

2.3 未知miRNAs的預測

運用miREvo[10]和mirdeep2[11]軟件來預測新的miRNAs, 從常溫和低溫組對蝦肝胰腺小RNA文庫中分別獲得38及46條novel miRNAs。這些未知的miRNAs在表達水平上存在極大的差異, 從幾十到幾千不等(TPM)。

2.4 miRNAs的差異表達分析及驗證

通過差異表達分析獲得25個低溫鍛煉下顯著差異表達的miRNAs, 其中有9個極顯著上調, 2個極顯著下調(表 2)。

為了進一步驗證這些miRNAs的表達模式, 運用實時熒光定量PCR對肝胰腺進行相對表達量的檢測。選取2條已知的miRNAs (mja-miR-6494、mja-miR-6491)及1條未知的miRNAs (novel_5)進行驗證。結果表明, mja-mir-6491、mja-mir-6494和novel_5在低溫相對于常溫呈現上調的趨勢。其中,mja-miR-6494及mja-miR-6491在低溫0表達水平迅速增加, 并達到峰值, 之后逐漸減少。而novel_5則是在低溫0表達水平開始增加, 在72h達到峰值(圖 1)。

表2 miRNAs顯著表達差異倍數分析結果Tab. 2 The fold-change of significantly differentially expressed miRNAs

圖1 通過實時熒光定量RT-PCR檢測miRNAs在常溫及不同低溫鍛煉條件下的表達模式Fig. 1 The relative expression of miRNAs under normal and cold-acclimated conditions assayed by qRT-PCR

2.5 差異表達miRNAs的靶基因預測

對差異表達的miRNAs進行靶基因預測, 再對每組差異表達miRNA的靶基因的集合分別進行GO和KEGG富集分析。GO總共分為3大功能類, 分別描述基因的分子功能(Molecular function)、所處的細胞位置(Cellular component)和參與的生物過程(Biological process)。GO分析的結果表明, 這些差異表達miRNAs的靶基因主要涉及生物過程(BP)中的生化過程(Biological process)、細胞過程(Cellular process)、代謝過程(Metabolic process); 細胞位置(CC)中的細胞組分(Cellular component); 生物過程(BP)中的分子功能(Molecular funcion)、結合(Binding)、蛋白結合(Protein binding)、催化活性(Catalytic activity)等等。KEGG數據庫記錄細胞中基因產物的功能以及基因產物的相互作用網絡。最顯著富集的KEGG通路為脂肪酸的降解 (Fatty acid degradation)及甘油酯代謝(Glycerolipid metabolism, 圖 2)。

2.6 差異表達miRNAs的靶基因驗證

被選取進行熒光定量PCR驗證相對表達量的4個基因: synapse-associated protein、nuclear export mediator factor、seleno proteins和DEAD-box RNA helicase Variant 1均為差異表達倍數極高的miRNAs的靶基因, 同時為課題組前期低溫轉錄組分析獲得的低溫顯著差異表達基因。部分顯著差異表達miRNAs的靶基因列表如表 3所示。熒光定量PCR的引物序列見表 4。如圖 3所示, synapse-associated protein及nuclear export mediator factor為低溫下調基因, 而seleno proteins及DEAD-box RNA helicase Variant 1為低溫上調基因。synapse-associated protein的表達量在低溫72h達到最低, nuclear export mediator factor在低溫24h達到最低。而DEAD-box RNA helicase Variant 1及seleno proteins的表達量在低溫72h達到最高。

圖2 差異表達miRNAs的靶基因KEGG通路預測Fig. 2 Prediction of target gene KEGG pathway for differentially expressed miRNAs

3 討論

自2001年首次發現miRNAs以來, 許多研究人員已經證實了miRNAs在多種動物應對環境壓力下的作用。在海龜中, 一些miRNAs, 包括tsc-miR-20a和tsc-miR-21, 可以調節缺氧和低溫反應下細胞的關鍵變化[12]。在昆蟲中, miR-1-3p和miR-284-3p被鑒定出在低溫反應中起重要的作用[13]。然而,凡納濱對蝦低溫反應miRNAs的數據仍然十分匱乏。迄今為止, 凡納濱對蝦miRNAs的研究主要集中在免疫防御上[7]。為了研究miRNAs在凡納濱對蝦低溫適應中的作用, 我們設計了低溫鍛煉實驗。通過高通量測序, 我們從常溫和低溫組對蝦肝胰腺小RNA文庫中鑒定出了miRNAs。表達分析表明,25個miRNAs在低溫下存在顯著的差異表達。在鑒定出的差異表達miRNAs中, mja-miR-6494和mjamiR-6491已被報道與日本對蝦的病毒感染有關[14]。此外, bta-miR-2478已被報道與牛的病毒感染有關[15]。因此我們推測miRNA在多種脅迫響應中具有復雜的調節作用。

表3 部分顯著差異表達miRNAs的靶基因Tab. 3 Partially significant differential expression of target genes for miRNAs

表4 差異表達miRNAs的靶基因的熒光定量PCR擴增引物Tab. 4 Primer sequences used for RT-qPCR of the targets of differentially expressed miRNA

圖3 通過實時熒光定量RT-PCR檢測靶基因在常溫及不同低溫鍛煉條件下的表達模式Fig. 3 The relative expression of target genes under normal and cold-acclimated conditions assayed by qRT-PCR

mja-miR-6491、mja-miR-6494和novel_5在低溫組對蝦肝胰腺的表達水平顯著高于常溫組。而在我們之前的研究中, 低溫脅迫下的凡納濱對蝦,包括胃蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶在內的消化酶的活性變化顯示出與此相反的模式, 即低溫脅迫24h后, 肝胰腺和胃腸道中這些消化酶的活性開始顯著降低[16]。類似的研究表明低溫應答型miRNA的靶基因在新陳代謝等生物學過程中富集[5]。因此推測, 凡納濱對蝦應對低溫主要的適應包括快速降低新陳代謝率等。在本研究中, KEGG途徑分析表明, 靶基因主要富集到與脂肪酸代謝有關的一些途徑中。此結果與前人的研究結果相符合。在大黃魚中, 脂肪酸的脫飽和是維持膜在低溫脅迫下流動性的重要適應機制[17]。在泥鰍中, 超長鏈脂肪酸延伸酶6 (elovl6)已被證明在適應低溫方面起主要作用[18]。

本課題組前期運用SSH及轉錄組測序篩選出低溫差異表達基因DEAD-box RNA helicase Variant的變異體- LvDDX5A, 并驗證出其表達規律為在18℃、15℃、13℃和11℃低溫脅迫36h均被誘導表達, 并隨著15℃和13℃低溫脅迫時間的增加呈先上升后下降的表達模式, 在48h達到峰值[19]。在本研究驗證的差異miRNA靶基因中, DEAD-box RNA helicase Variant 1為低溫上調基因, 表達量在16℃低溫鍛煉72h達到最高, 此結果與課題組前期研究相符。另外3個差異miRNA的靶基因-synapse-associated protein、nuclear export mediator factor及seleno proteins也是項目組前期進行低溫轉錄組測序中篩選出的顯著差異基因。因此, 這4個低溫差異miRNAs的靶基因很可能為凡納濱對蝦的耐寒相關基因。為了進一步驗證miRNAs對靶基因的調控,課題組計劃將運用RNA 免疫共沉淀 CLIP-Seq 技術對miRNAs及其靶基因進行驗證。