山莨菪堿預(yù)防糖尿病大鼠對比劑腎病的作用機制

宗春輝 趙凱 高巧營 李東華 戈立秀 劉晉津 吳騰 張一 張琦

(天津市南開醫(yī)院，天津 300100)

近十幾年來，隨著對比劑在臨床中的應(yīng)用越來越廣泛，對比劑腎病(CIN)的發(fā)生率亦呈上升趨勢，已成為醫(yī)源性急性腎損傷的重要原因之一〔1〕。造成CIN的誘因有多種，如高齡、高血壓、糖尿病、慢性腎功能不全等，其中糖尿病是發(fā)生CIN最常見的危險因素之一〔2〕。目前CIN的發(fā)病機制尚不明確，相關(guān)的防治指南僅推薦水化做為預(yù)防CIN的措施。已有大量研究顯示普羅布考可抗氧化應(yīng)激、降低氧自由基的水平，具有預(yù)防及減少CIN發(fā)生的作用〔3，4〕；山莨菪堿亦對急性冠脈綜合征合并糖尿病腎病患者擇期冠狀動脈介入術(shù)(PCI)術(shù)后腎功能具有良好的保護(hù)作用〔5〕，但具體機制不詳。本研究探討山莨菪堿對糖尿病大鼠CIN的預(yù)防作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物和主要試劑、儀器 健康SD大鼠40只，8周齡，體重(250±20)g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院環(huán)境所動物中心。鏈脲佐菌素購自美國Sigma公司；山莨菪堿購自天津金耀藥業(yè)有限公司；普羅布考購自承德頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司；對比劑60%泛影葡胺購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司；血清肌酐(Scr)試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3抗體、caspase-9抗體、B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2 抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt，Ser473) 抗體、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR，Ser2448)抗體、磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(p-ERK)、磷酸化氨基末端蛋白激酶(p-JNK)、p-P70S6K、β-肌動蛋白(actin)均購自Cell Signaling公司；蛋白核算測定儀購自Eppendorf AG公司；Western印跡電泳設(shè)備、凝膠成像系統(tǒng)均購于Bio-Rad公司；病理包埋機、切片機均購于LEICA公司；LEICA DM4000B正置顯微鏡購自德國leica公司。

1.2糖尿病大鼠模型建立及分組 給予SD大鼠標(biāo)準(zhǔn)鼠食，實驗開始前適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，造模前測大鼠尾靜脈血糖，均顯示在正常范圍。所有大鼠以腹腔單劑量注射鏈脲佐菌素60 mg/kg建立糖尿病模型，注射后72 h及7 d后斷鼠尾取血測血糖，以非禁食血糖>16.7 mmol/L判定糖尿病大鼠模型成功。隨機將糖尿病模型大鼠分為對照組(N組)、CIN模型組(M組)、山莨菪堿組(A組)、普羅布考組(P組)，每組10只。

1.3CIN模型建立 飼養(yǎng)10 w后，P組大鼠給予普羅布考(500 mg/kg)灌胃，N組和M組以等量生理鹽水灌飼，連續(xù)6 d，第7天禁水不禁食。7 d后，麻醉狀態(tài)下，在腹腔注射泛影葡胺前15 min，A組給予山莨菪堿100 μg/100 g腹腔注射，N組、M組、P組給予等量生理鹽水腹腔注射。A組在注射泛影葡胺后4 h內(nèi)每小時腹腔注射1次山莨菪堿100 μg/100 g，第4～12小時每隔4 h重復(fù)腹腔注射1次山莨菪堿，N組、M組、P組于相應(yīng)時間腹腔注射等量生理鹽水，以Scr比N組升高>25%判定CIN模型成功。

1.4實驗取材 分別于注射泛影葡胺前、注射后24 h，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，開腹取下腔靜脈血2 ml，迅速取下雙腎。左腎剖開部分固定于甲醛，以備腎臟病理研究；部分-80℃凍存，用于檢測氧化應(yīng)激指標(biāo)；右腎-80℃凍存，用于Western印跡蛋白定量分析。

1.5相關(guān)指標(biāo)的檢測

1.5.1血、尿生化指標(biāo)檢測 包括血糖、Scr、尿素氮(BUN)、尿中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)等，按照試劑盒說明書利用半自動生化儀測定。

1.5.2腎組織勻漿氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測 采用硝酸還原酶法測定一氧化氮(NO)水平，黃嘌呤氧化酶法檢測超氧化物歧化酶(SOD)活力，硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)含量，比色法測定總抗氧化能力(T-AOC)水平。

1.5.3病理學(xué)形態(tài)檢測 腎組織常規(guī)脫水石蠟包埋，切片后進(jìn)行梯度酒精脫水、透明、HE染色，于正置顯微鏡下觀察腎臟組織病理變化。

1.5.4Western印跡檢測 提取腎組織總蛋白、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗原抗體反應(yīng)、放射自顯影，檢測腎組織Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9、p-Akt、p-mTOR、p-ERK、p-JNK、p-P70S6K、β-actin蛋白表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件，計量資料組間比較采用方差分析；計數(shù)資料采用χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠造影24 h后腎臟功能指標(biāo)變化情況 與N組比較，M組、P組Scr、BUN及NGAL含量均明顯升高(P<0.05，P<0.01)；A組BUN升高(P<0.05)。與M組比較，A組Scr、BUN 及NGAL含量均明顯降低(P<0.05,P<0.01)。見表1。

2.2腎組織勻漿氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測 造影24 h后，與N組比較，NO、一氧化氮合酶(NOS)含量在M組明顯升高(P<0.05)；MDA含量在M組、A組、P組均明顯升高(P<0.01)；SOD、T-AOC含量在M組、A組、P組均明顯下降(P<0.01)。與M組比較，NO、NOS含量在A組、P組均明顯升高(P<0.05，P<0.01)；MDA含量在A組、P組均明顯降低(P<0.01)。見表2。

2.3HE染色檢測各組大鼠腎小球、腎小管損傷程度 N組腎小球、腎小管上皮細(xì)胞未見明顯損傷；M組腎小球基底膜增厚，近曲小管腫脹，胞質(zhì)嗜酸性、細(xì)顆粒狀，結(jié)構(gòu)不清，遠(yuǎn)曲小管萎縮，胞質(zhì)透明變性。A組、P組病理形態(tài)相似，腎小球基底膜無明顯增厚，近曲小管及遠(yuǎn)曲小管結(jié)構(gòu)清晰。見圖1。

表1 藥物干預(yù)后各組腎功能比較

與N組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與M組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

表2 給予藥物干預(yù)后各組腎臟NO、NOS、MDA、SOD、T-AOC的變化

圖1 HE染色檢測各組腎小球、腎小管損傷(×400)

2.4電鏡檢查各組大鼠腎小球、腎小管損傷 N組腎小球、腎小管細(xì)胞未見明顯損傷。M組腎小球血管袢基底膜部分增厚，并有細(xì)密的顆粒物沉積，基膜近系膜側(cè)明顯增厚，部分足突融合；腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)可見多量空泡，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度腫脹脫顆粒；線粒體嚴(yán)重腫脹，嵴斷裂、部分消失；腎小管腔面微絨毛大量脫落，基底膜嚴(yán)重增厚。A組腎小球血管袢基底膜大部分厚度均勻，有局灶性增厚；大部分血管內(nèi)皮窗孔均勻分布，足突分布均勻，極少量融合。 P組腎小球血管袢基底膜厚度基本均勻，血管內(nèi)皮穿孔分布均勻，足突裂隙均勻分布；腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見少量溶酶體，部分線粒體排列輕度紊亂，腎小管基底膜厚度基本正常。見圖2。

2.5線粒體Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量比較 四組之間Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(分別為F=157.75，P<0.05；F=108.81，P<0.05)，采用SNK-Q檢驗對Bcl-2、Bax在四組間進(jìn)行兩兩比較，得到Bcl-2蛋白表達(dá)量在N組、M組、A組、P組逐漸增加；Bax蛋白表達(dá)量在N組、M組、A組、P組逐漸減少，見圖3，表3。

2.6Akt/mTOR/P70S6K通路蛋白量比較 四組之間p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K蛋白表達(dá)量差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(分別為F=1 390.76，P<0.05；F=2 599.42，P<0.05；F=4 721.76，P<0.05)。采用SNK-Q檢驗對上述三種蛋白各自進(jìn)行四組兩兩比較，各組間蛋白表達(dá)量差異一致，在N組、M組、A組、P組逐漸增加，見表3，圖4。

2.7MAPK(p-ERK、p-JNK)通路蛋白量表達(dá)變化 四組之間p-ERK、p-JNK蛋白表達(dá)量差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(分別為F=1 059.66，P<0.05；F=1 456.56，P<0.05)。采用SNK-Q檢驗對上述兩種蛋白各自進(jìn)行兩兩比較，p-ERK蛋白表達(dá)量在N組、M組、A組、P組逐漸增加；p-JNK蛋白表達(dá)量在N組、M組、A組、P組逐漸減少，見表3，圖5。

圖2 電鏡檢查各組腎小球、腎小管損傷(×20 000)

圖3 不同組別線粒體Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量比較

組別Bcl-2Baxp-AKtp-mTORp-P70S6Kp-ERKp-JNKcaspaes-3caspaes-9N組0.49±0.041.10±0.040.79±0.020.38±0.010.35±0.010.72±0.031.84±0.020.61±0.040.96±0.03M組0.61±0.071.05±0.040.81±0.020.42±0.020.37±0.010.78±0.011.07±0.020.53±0.030.77±0.02A組0.70±0.061.01±0.281.19±0.020.74±0.020.94±0.011.07±0.020.94±0.020.44±0.020.67±0.03P組0.94±0.060.89±0.051.25±0.020.86±0.010.97±0.011.36±0.030.89±0.020.40±0.020.58±0.03

圖4 Akt/mTOR/P70S6K通路蛋白表達(dá)比較

圖5 MAPK(p-ERK、p-JNK)通路蛋白量表達(dá)比較

2.8caspase-3/9蛋白量表達(dá)變化 四組之間caspase-3/9蛋白表達(dá)量差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(分別為F=112.22，P<0.05；F=938.80，P<0.05)；采用SNK-Q檢驗別caspase-3/9在四組間進(jìn)行兩兩比較，得到蛋白表達(dá)量在N組、M組、A組、P組逐漸減少，表3，見圖6。

圖6 不同組別caspase-3/9蛋白表達(dá)量比較

3 討 論

流行病學(xué)研究顯示，糖尿病是CIN發(fā)生的最常見危險因素之一〔6〕，且多項研究已證明其為CIN發(fā)生的獨立危險因素，發(fā)病率為5.7%～29.4%〔7〕。傳統(tǒng)的CIN檢測指標(biāo)為BUN、Scr，但易受多種因素影響如年齡、性別、高蛋白飲食、脫水狀態(tài)等〔8〕。近年來，隨著腎損傷相關(guān)檢測手段和評價方法的不斷改進(jìn)，多種敏感性好、特異性高的標(biāo)志物不斷涌現(xiàn)，目前有較多證據(jù)支持的新型標(biāo)志物是NGAL〔9～12〕。有研究顯示，檢測NGAL水平不僅能早期發(fā)現(xiàn)CIN，還能預(yù)測腎損傷的嚴(yán)重程度〔13〕。本研究結(jié)果說明用藥后腎組織損傷程度有所改善。

目前CIN的發(fā)病機制尚不明確，比較公認(rèn)的有對比劑誘發(fā)腎小管氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)氧自由基及脂質(zhì)過氧化物形成，促進(jìn)腎血管收縮物質(zhì)的釋放從而抑制NO生成，加重腎缺血缺氧，誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞凋亡等。CIN的防治措施比較明確的有水化治療，但臨床上被證實確切有效的藥物并不多。近年來有研究發(fā)現(xiàn)山莨菪堿、普羅布考有改善CIN腎損傷的作用〔14，15〕。山莨菪堿是茄科植物唐古特莨菪中的一種生物堿，其改善腎功能的機制為〔16〕：(1)通過提高清除氧自由基的能力，提高機體對缺血缺氧的耐受性，激活SOD起到抗氧化應(yīng)激的作用。(2)抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低MDA含量。(3)通過增加NO含量發(fā)揮改善微循環(huán)的效應(yīng)。(4)抑制腎臟細(xì)胞凋亡。普羅布考是唯一FDA認(rèn)證的人工合成抗氧化藥物，最初作為降脂藥物應(yīng)用于臨床。近年來因其強大的抗氧化作用、防止過氧化物對內(nèi)皮的損傷等功能成為抗動脈粥樣硬化、預(yù)防高脂血癥內(nèi)皮損傷的熱點藥物〔17〕。趙凱等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)，接受PCI治療的不穩(wěn)定型心絞痛老年患者預(yù)防性應(yīng)用普羅布考可有效減少CIN的發(fā)生。耿毓汕〔19〕研究表明普羅布考通過改善機體氧化應(yīng)激狀態(tài)、降低血清C反應(yīng)蛋白(CRP)和炎性介質(zhì)的釋放起到保護(hù)CIN腎功能的作用。本研究表明山莨菪堿、普羅布考通過提高NO、NOS含量，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)起到抗氧化應(yīng)激反應(yīng)、改善腎小管上皮細(xì)胞微循環(huán)、促進(jìn)腎組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)的作用，達(dá)到改善腎功能的目的。

CIN 發(fā)生進(jìn)展中，細(xì)胞凋亡是其發(fā)病機制之一。經(jīng)典的細(xì)胞凋亡信號途徑有外源性途徑和內(nèi)源性途徑，分別由死亡受體介導(dǎo)和線粒體途徑介導(dǎo)。內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑中最主要的調(diào)控因子為線體Bcl-2家族，其中抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax在家族中最具代表性。體外研究〔20〕已證實，對比劑可通過激活活性氧(ROS)磷酸化p53，影響線粒體Bcl-2基因的表達(dá)使Bcl-2/Bax比值下調(diào)，并通過激活線粒體caspase信號通路，導(dǎo)致caspase-3/9表達(dá)量增加，促進(jìn)腎細(xì)胞凋亡。Andreucci等〔21〕通過體外研究發(fā)現(xiàn)，Akt/mTOR/P70S6K 途徑去磷酸化失活參與了造影劑引起的腎小管上皮細(xì)胞凋亡。動物實驗表明〔22〕，腎缺血可誘導(dǎo)JNK活性增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有研究認(rèn)為〔23，24〕激活ERK通路可有效抑制缺氧再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞調(diào)亡的發(fā)生。本研究結(jié)果提示，山莨菪堿通過上調(diào)Bcl-2/Bax比值，恢復(fù)了線粒體Bcl-2家族的平衡，并通過其強大的抗氧化功效激活磷酸化的Akt/mTOR/P70S6K信號通路和p-ERK的磷酸化信號途徑，下調(diào)促調(diào)亡上游信號p-JNK的表達(dá)，最終經(jīng)家族傳遞“保護(hù)”信息，從而抑制了線粒體caspase-3/9通路的激活，起到減輕腎細(xì)胞凋亡、保護(hù)腎功能的作用。

綜上所述，山莨菪堿通過抗氧化應(yīng)激、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、上調(diào)Bcl-2/Bax比值、激活磷酸化的Akt/mTOR/P70S6K和p-ERK信號通路，抑制caspase-3/9通路的激活，發(fā)揮了保護(hù)糖尿病大鼠對比劑急性腎損傷的作用。