特應性皮炎患兒與正常兒童腸道菌群差異性研究

羅瑞靜 劉杰 彭勇 王英杰 武宗琴 姜珠倩 李淑 柴維漢 李斌

1上海市嘉定區中醫醫院皮膚科 201899；2上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院皮膚科 200437

特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）是皮膚科常見的慢性炎癥性皮膚病之一，嚴重影響患者生活質量［1］。其發病與遺傳所致免疫紊亂、皮膚屏障功能障礙、環境因素及其交互作用密切相關，其中機體免疫功能異常被認為是發病關鍵機制［2］。有研究報道，腸道菌群與AD的發生及發展關系密切［3］。本研究探討特應性皮炎患兒與正常兒童腸道菌群差異。

一、對象與方法

1.對象：2015 年 4 月至 2017 年 4 月在上海市嘉定區中醫醫院皮膚科門診就診的AD 患者。納入標準：①符合Williams［4］診斷AD 標準；②6 ～ 12 歲兒童；③無其他皮膚疾病；④無心、肝、腎等各系統嚴重異常；⑤無精神疾病、殘疾、智力障礙；⑥近2個月未內服過糖皮質激素或近2周內未外用過此類藥品；⑦近2 周未患腹瀉等腸道疾病或使用抗生素；⑧近2 周未服用含益生菌等微生物制劑。健康對照組兒童來自上海市嘉定區城中路小學和普通小學，6 ～12歲，無皮膚疾病，無過敏性鼻炎、哮喘等過敏性疾病史。

符合納入標準的AD患兒35例，男22例，女13例，平均年齡 8.9 歲；健康對照兒童 27 例，男 17 例，女 10 例，平均年齡8.0歲。兩組入選者年齡、性別差異均無統計學意義。本研究通過嘉定區中醫醫院醫學倫理委員會批準（2014006），研究對象及監護人均簽署知情同意書。

2.樣本采集：取受試者糞便標本（＞1 g）存儲于-20 ℃冰箱。干冰運送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行檢測與測序分析。

3.DNA 提取及測序、分析：根據EZNA?soil 試劑盒（美國Omega Bio-tek 公司）說明書抽提總DNA，檢測DNA 濃度和純度，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質量。采用338正向引物：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′和806反向引物：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，PCR擴增細菌的16SrRNA基因V3～V4區。

4.基因測序及分析：應用上海美吉生物醫藥科技有限公司Illumina Miseq 測序平臺對研究對象糞便細菌的16SrRNA基因V3～V4區進行高通量測序及分析。

5.統計學分析：通過I-Sanger 生物信息云平臺（http：//www.i-sanger.com），應用軟件：R 的stats 包和python 的scipy包進行分析。選擇兩組豐度排名前15 的門、屬、種分別比較物種差異，采用Wilcoxon 秩和檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

二、結果

1.樣本信息統計：原始序列去雜處理后，62份樣本共獲得2 269 944 條優化序列供后續分析，平均長度435.96 bp，其中99.95%的序列長度集中在400 ～500 bp，基本覆蓋了16SrDNA V3+V4 雙高變區的全長。對樣本物種注釋分類后，共獲得1個域，16個門，30個綱，48個目，82個科，230個屬，427個種，569個可操作分類單元（OTU）。

2.兩組在門、屬、種水平物種差異比較：兩組中占優勢的菌門有厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）。菌門水平，AD組擬桿菌門豐度為29.16%±19.96%，健康對照組為39.06% ± 15.98%，兩組差異有統計學意義（P= 0.042）；梭桿菌門分別為 0.06% ± 0.17%、0.50% ± 1.71%（P=0.041）。見圖1。在菌屬水平，擬桿菌屬豐度分別為23.77% ±18.08%、33.1% ±15.75%（P=0.029）。見圖2。在菌種水平豐度排名前15的菌種中，兩組間分布差異均無統計學意義（均P＞ 0.05）。見圖3。

圖1 特應性皮炎組與健康對照組腸道菌群在菌門水平豐度的比較

圖2 特應性皮炎組與健康對照組腸道菌群在菌屬水平豐度的比較

圖3 特應性皮炎組與健康對照組腸道菌群在菌種水平豐度的比較

三、討論

隨著腸道菌群與AD的關系研究不斷深入，給進一步闡明該病發病機制帶來了新的方向［5］。最近開展的動物研究也提出了可以通過調節腸道菌來實現治療的可能性［6］。本研究借助Illumina Miseq 測序平臺對AD患兒與健康對照兒童糞便細菌的16SrRNA 基因V3～V4 區進行高通量測序，比較兩組在門、屬、種水平物種差異。

結果顯示，兩組在菌門水平占優勢的群落有厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門，這一研究結果基本符合正常人體腸道菌群門水平構成情況［7］，但兩組間腸道菌群構成存在一定差異，在菌門水平，AD 組擬桿菌門及梭桿菌門群落豐度較健康對照組降低；在菌屬水平，AD 組擬桿菌屬群落豐度降低；而在菌種水平，在豐度排名前15的菌種中，兩組間分布差異均無統計學意義。總之，兩組腸道菌群的構成及菌群相對豐度存在一定差異。

目前已有研究證實，AD患者與正常人腸道菌群存在差異，Kirjavainen等［8］發現，AD患兒哺乳期表現為革蘭陽性菌減少，且斷奶后該差異更加明顯。Kalliomaki 等［9］發現，AD患兒糞便中梭狀芽胞桿菌數較正常兒童多，而雙歧桿菌數少。Watanabe等［10］發現，AD患者雙歧桿菌計數低于健康對照組，葡萄球菌檢出率高于正常對照組，推測腸道菌群失調可能在AD 發病和皮膚癥狀加重中起一定作用。Penders等［11］通過隊列研究顯示，在AD患兒中大腸桿菌和難辨梭狀芽胞桿菌定植存在差異。Song等［12］采用16SrRNA基因檢測技術檢測糞便中腸道菌群，發現F 梭菌內部失衡。Suzuki等［13］發現，在生命早期機體可以通過調節腸道中雙歧桿菌數量來調控白細胞介素10 進而影響AD 的發生。Nowrouzian 等［14］發現，生命早期金黃色葡萄球菌定植異常及其攜帶的超抗原和黏附素基因與后期發生AD相關。Lee等［15］發現，AD 患兒腸道菌群與正常人存在差異，且宏基因組分析揭示，AD患者腸道菌群中免疫發展相關的功能基因與正常人存在差異。已有研究探討AD 患者生命早期腸道菌群變化情況，然而3歲之前腸道菌群仍處于變化階段，易受飲食等因素影響而發生變化［16］，為此，本研究選擇6 ～12歲兒童，其腸道菌群趨于穩定，比較研究價值更大。

綜上，AD患兒與正常兒童腸道菌群構成及菌群相對豐度存在一定差異，但與已有研究并不完全相同，考慮可能與研究對象、檢測方法、樣本量、檢測技術的局限性等因素相關，今后應進一步深入研究其具體作用機制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突