熒光量子點標記技術在生物醫藥領域的研究進展

高勇 郭艷 安維 韓亞麗 張娟麗

摘要：熒光量子點標記技術作為熒光標記技術領域的最為先進的技術，因其無放射污染性、低細胞毒性以及檢測技術成熟等優點，已經成為現代生物醫藥領域研究中的不可或缺的手段和技術。本文從各類熒光量子點制備、表面功能化方面的最新技術進行詳細論述，對其在生物醫藥領域的如細胞內外物質追蹤、生物組織成像、疾病早期診斷等方面的研究趨勢和應用前景進行了展望。

Abstract： Fluorescent quantum dot labeling technology， as the most advanced technology in the field of fluorescent labeling technology， has become an indispensable means and technology in the research of modern biomedicine because of its advantages of no radioactive contamination， low cytotoxicity and mature detection technology. In this paper， the latest technologies in various quantum dot preparation and surface functionalization are discussed in detail， and the research trends and application prospects in the field of biomedicine， such as intracellular and extracellular material tracking， biological tissue imaging， early disease diagnosis， etc.， are prospected.

關鍵詞：熒光標記;量子點;生物醫藥;應用研究

Key words： fluorescent labeling;quantum dots;biomedical;application research

中圖分類號：Q503 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號：1006-4311（2019）30-0280-03

0 ?引言

熒光標記技術與放射性物質標記、發光物質標記、生物酶標記技術一并被稱為應用分析標記技術，由于其無放射性污染、低細胞毒性以及檢測方法成熟可靠等突出優點，已經成為現代生物醫藥領域研究中的不可或缺的手段和技術。

熒光量子點（Quantum Dots）[1]作為無機熒光材料的典型代表，屬于人工制備納米半導體材料，粒徑范圍在1-20nm之間，可依據其粒徑的大小具備不同的熒光顏色，常見的類型如 II-VI 類（Cd Te、Cd Se、Cd S），II-V類（In P、 In As），I-III-VI2 類（Cu In S2、Ag In S2）和 IV-VI 類（Pb Se）。這些量子點在各種醫學應用如生物成像，生物信息的傳感和藥物的遞送等眾多的應用中發揮著非常重要的作用。

熒光量子點是近年來被廣泛研究的熒光標記探針技術，相對于熒光素類、羅丹明類常見有機熒光標記分子，其接受激發波長范圍寬，并且產生發射波長分布窄，可以實現一種激發波長同時激發多種不同粒徑和材質的多種量子點，實現多種標志物的同時監測，并具有較強的抗光譜漂白能力;由于是穩定合成的化學納米物質，其光源穩定性好，不易產生熒光淬滅，穩定時間長;可供選擇的低細胞毒性、高生物相容性量子點逐漸被發現，能夠進行體內成像的研究;其生物標記方法，可通過其表面的多種化學基團，進行生物分子如特異性抗體的標記和示蹤。

1 ?熒光量子點的制備

量子點的合成研究是關于量子點研究的重要內容，具有基礎性的地位，一直以來受到國內外研究者的重視。目前熒光量子點制備主要分為有機相合成和水相合成兩大類。另外，近年來生物合成方法也被逐漸的開發出來。

1.1 有機相合成

1993年Bawendi[2]出現了一種新的合成方法：“金屬有機-配位溶劑-高溫”路線，以TOPO和TOP為溶劑、以Cd（Et）2和S（Se、Te）反應前驅體，高溫情況下，向含有Cd（Et）2的TOPO溶液注入S（或Se、Te）的TOP溶液，使其高溫下成核生長。該合成方法形貌可控，發光效率高，但是高溫，Cd（Et）2劇毒，不穩定，成本高，容易爆炸等缺點限制了其應用。Peng[3]在前人的研究的基礎上，從基本的化學知識出發，找到了控制合成的關鍵因素，主要是針對Cd（Et）2的劇毒，不穩定，合成條件苛刻等方面進行了創新研究。最新的制備可以在非極性溶液中對其形貌生長進行精確控制，以合成應用最為廣泛的量子點。

1.2 水相合成

水相合成的量子點具有無毒性和優越的生物相容性等優點，Weller[4]研究了引入巰基小分子束縛量子點的生長，在水相中合成CdTe量子點。董紹俊[5]使用Na2TeO3作為Te源，將其和Cd2+、配體分子、NaBH4加熱回流，得到高質量的CdTe量子點。2014年，Wu等[6]水相制備CdTe 量子點，并進行蛋白修飾。

1.3 生物合成

利用各種生物體進行熒光量子點的胞內外合成是近幾年量子點合成一個研究熱點，2009年pang[7]等提出了全新的“時-空耦合調控活細胞合成策略”，開啟生物合成的先河。目前硫族量子點CdS在生物合成方面研究的最為深入[8]。可供生物合成的量子點微生物有細菌（大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、光合細菌沼澤紅假單胞菌等），真菌（酵母）等。2015年，Borovaya等[9]首次證實擔子真菌系統合成硫化鎘量子點的可能。另外在其他生物機體如放線菌、藍藻、植物（番茄毛根等）、病毒（煙草花葉病毒等）、動物（蚯蚓）也被發現可以用來合成量子點[12]。但是這類方法合成的量子點種類有限，且發光效率不高，以及產能的制約等不足，目前無法大規模的工業化應用。

在上述化學和生物合成的方法基礎上，量子點制備技術不斷進步，多元素、多材料的復合結構使得量子點的發光性質更加穩定，應用更加的廣泛。

2 ?熒光量子點的功能化和標記

熒光量子點的功能化主要是對量子點表面進行一系列的修飾，使得可以和生物大分子等物質連接，進一步在生物醫學領域應用。針對表面修飾基本策略是兩個：第一個是包裹，在表面包裹上親水性物質，使其親水;第二個是替換，將表面配體替換成親水的物質使其親水。這兩個策略來自1998年[10][11]Alivisatos和Nie，兩人從不同的角度解決了這個問題，開啟了生物應用的大門;Alivisatos在量子點表面包覆了一層硅，再利用相關硅烷的反應，在量子點表面修飾了親水的氨基，而Nie則利用配體交換策略，在量子點表面修飾了親水的巰基羧酸，之后再利用量子點表面修飾的基團進行蛋白等大分子連接，作為熒光探針進一步的應用。早期的比較常用的修飾方法是建立在這2個策略之上，利用兩親性分子、小分子肽段疏水包裹法[12][13] [14]。水溶性配體交換的方法常用的配體交換試劑有巰基小分子、谷胱甘肽等[14][15][16]，這類修飾的方法有一個共同的特點是量子點表面的配體發生了變化，熒光效率會有不同的下降。還有將量子點包裹在二氧化硅微球中、塊狀共聚物膠束中、聚苯乙烯微球大大提高了檢測的敏感性，此類的修飾方法基于多個量子點單體聚合成多個，檢測敏感性提高，但修飾方法合成工藝復雜，要求高，形貌不易控制，修飾后的量子點一般在1-10um，尺寸的增大限制了其應用。近年來將量子點使用兩親性聚合物修飾[17][18][19]，這類聚合物有羧甲基殼聚糖和辛胺接枝的聚丙烯酸、聚丙烯馬來酸酸酐等不僅可以保證發光效率，而且制備的微球粒徑可控、穩定，易于工業化生產。因此采用不同類型的聚合物修飾量子點來達到應用目的是當前重要的研究熱點。

功能化的量子點進行生物交聯標記常用方法有EDC法、戊二醛法和SMCC（或SPDP）法等。表面有羧基官能團的量子點可以使用EDC將其活化后與生物分子的氨基進行連接;而表面有羧基官能團的量子點則可以使用戊二醛將其活化后再連接生物分子的氨基，或者使用SPDP活化后連接生物分子上的巰基（生物分子無巰基時還可以用ITL試劑在其氨基上連接上巰基）。

3 ?熒光量子點的生物醫學應用

量子點生物學應用的起步始于1998年，Alivisatos和Nie同時創新性的解決了量子點標記后的生物相容性難題，實現生物大分子與量子點的結合。隨后量子點開始廣泛應用于包括DNA檢測技術、免疫熒光技術和細胞生物學的多種生物技術中。

3.1 量子點在體內應用

Alivisatos等人采用兩種量子點標記小鼠的成纖維細胞，證明可以將生物分子通過靜電力、氫鍵或者親和力結合在量子點表面。Nie等人使用巰基乙酸改性過的CdSe量子點，與轉鐵蛋白化學交聯后，可借助轉鐵蛋白進入細胞內部，可追蹤供體-受體反應。Gao[20]等利用單細胞標記分析更加高效將量子點在生物細胞方面的應用向前推進。張炎[21]等研究了新型水溶性量子點Zn3In2S6與抗CEA抗體形成熒光探針，對結腸癌細胞株進行靶向標記，合成的熒光探針的細胞毒性大幅降低。Nafiujjaman[22]的研究表明，新型的Cl-GQDs-N量子點直徑在30nm左右，并且在體外試驗中表明，對癌細胞和正常細胞，均沒有毒性作用，具備在細胞成像方面的應用前景。

3.2 生物成像方面

由于近紅外光（650-900nm波長范圍）不易被生物體內背景吸收，所以量子點在活體成像方面具備不可比擬的優勢。Akerman M E，Gao等人[23][24]證實通過小鼠靜脈注射生物標記的量子點后，量子點能夠特異性的聚集在小鼠的特定組織上并且成功的顯像。

3.3 量子點在體外診斷

量子點應用在體外診斷中，主要用作為熒光探針作為信號物質，從而直接或間接的用于蛋白質的檢測。李萌[25]等采用EDC/NHS的辦法將HCV核心抗原的一株抗體偶聯到量子點上，磁微粒連接另一株抗體，建立雙抗體測HCV核心抗原的快速檢測，檢測時間和靈敏度較傳統的ELISA都有提高。郭愛玲[26]等使用EDC/NHS將制備好的CdS量子點與單增李斯特菌抗體IgG偶聯，偶聯CdS量子點的單增李斯特菌抗體的特性沒有發生變化，之后采用直接熒光法在熒光顯微鏡下快速靈敏地檢測出了單增李斯特菌。余皓[27]等制備CdSe/ZnS量子點，再將量子點標記抗抗鈣素單抗，制備成免疫層析試紙條及其配套熒光檢測設備用于檢測血液中PCT，檢測結果和現有方法一致，具有無需前處理可全進行血測量、熒光檢測設備成本低、操作簡便等優勢。Hao Yu[28]等將量子點多色的功能和層析紙條結合，采用雙色（575nm和640nm）量子點分別標記CRP和PCT的抗體構建免疫層析系統，同時在血液中快速檢測CRP和PCT。Jinghua He[29]等使用量子點作為熒光探針，雙抗體夾心法在試紙條上檢測腫瘤標志物CA724和羅氏的電化學發光法基本一致，開始向腫瘤標志物檢測領域延伸。

4 ?展望

熒光量子點作為標記物有著其獨特的優勢：較大的斯托克斯位移，從而不受激發光源的干擾;可以實現多色熒光，而激發光波長一種即可;抗光漂白性極強，有著非常長的熒光壽命;有著很高的量子產率，熒光信號極強等優點。近年來，國內外學者對熒光量子點的制備和標記方法進行了大量的研究，我國學者對量子點在生物醫學方面的應用進行了較深入的研究，對進一步商業化、產業化夯實了基礎。

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